[發(fā)明專利]一種跨膜蛋白脂質(zhì)體硅膠復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910973565.0
• 申請日: 2019-10-14
• 公開（公告）號: CN110812887A
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭樂藝;陳嘯飛;柴逸峰;朱臻宇;洪戰(zhàn)英;曹巖;顧妍秋
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: B01D15/08
• 分類號: B01D15/08;B01J20/281;G01N30/02
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 孫躍虹

本發(fā)明公開了一種跨膜蛋白脂質(zhì)體硅膠復(fù)合物，是由質(zhì)量比為1:(300～500):(700～900)的跨膜蛋白、脂質(zhì)體、硅膠制成。本發(fā)明還提供了一種所述跨膜蛋白脂質(zhì)體硅膠復(fù)合物作為色譜固定相的應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建了一種新型的跨膜蛋白?脂質(zhì)體?硅膠復(fù)合物生物色譜固定相，并對制備方法學(xué)進(jìn)行了考察，解決了蛋白脂質(zhì)體鍵和色譜固定相的技術(shù)難題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉一種跨膜蛋白脂質(zhì)體硅膠復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

跨膜蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有一個或多個疏水性的跨膜區(qū)，其純化重組以及保存都離不開去污劑的存在。但是在去污劑存在的環(huán)境下，蛋白的結(jié)構(gòu)和功能均遭到一定的破壞，藥物與跨膜蛋白的相互作用也與體內(nèi)實際情況差別較大。針對體外模擬跨膜蛋白天然構(gòu)建這一難題，相關(guān)學(xué)者發(fā)展了一系列新的模型和分析技術(shù)，其中最具有代表性的就是蛋白脂質(zhì)體重構(gòu)技術(shù)，其原理是使用各種脂質(zhì)體重組形成模擬細(xì)胞膜環(huán)境的人工膜，然后將跨膜蛋白鑲嵌于其上，體外模擬跨膜蛋白天然構(gòu)建和環(huán)境，來表征其與藥物的相互作用。然而，蛋白脂質(zhì)體不具備剛性結(jié)構(gòu)，不能作為色譜固定相，因此無法適用于快速便捷的液質(zhì)聯(lián)用這類高效的藥物分析方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是提供一種跨膜蛋白脂質(zhì)體硅膠復(fù)合物。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種所述跨膜蛋白脂質(zhì)體硅膠復(fù)合物的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種所述跨膜蛋白脂質(zhì)體硅膠復(fù)合物作為色譜固定相的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的第一個方面提供了一種跨膜蛋白脂質(zhì)體硅膠復(fù)合物，是由質(zhì)量比為1:(300～500):(700～900)的跨膜蛋白、脂質(zhì)體、硅膠制成，質(zhì)量比優(yōu)選的比值為1:400:800。

所述跨膜蛋白是鑲嵌于脂質(zhì)體雙分子層中，兩端暴露于細(xì)胞膜內(nèi)外表面的蛋白質(zhì)，具體選用的是細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白、卷曲蛋白受體4(FZD4)。

所述脂質(zhì)體為具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的人工膜，是由摩爾比為(70～90):(10～30):(1～10)的二油酰基磷脂酰膽堿、二油酰基磷脂酰甘油、7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑基修飾的二油酰基磷脂酰乙醇胺制成，摩爾比優(yōu)選為80:20:5。

本發(fā)明的第二個方面提供了一種所述跨膜蛋白脂質(zhì)體硅膠復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

將摩爾比為(70～90):(10～30):(1～10)的二油酰基磷脂酰膽堿、二油酰基磷脂酰甘油、7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑基修飾的二油酰基磷脂酰乙醇胺混合，加入溶劑充分震搖使其溶解，除去溶劑，加入PBS充分震蕩重溶，孵育后超聲成囊泡狀，微孔濾膜過濾，獲得所述脂質(zhì)體；

將活化后的硅膠與脂質(zhì)體混合1～60min，在冰浴條件下攪拌1～60min，溫度為0～5℃的條件下靜置保存過夜，然后在溫度為0～5℃的條件下離心分離，沉淀用PBS重懸，重復(fù)該步驟2次，獲得脂質(zhì)體-硅膠復(fù)合物；

采用Cy3熒光標(biāo)記試劑盒對細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白進(jìn)行標(biāo)記，得到Cy3熒光標(biāo)記的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白，蛋白終濃度為1～10mg/mL，將細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白與脂質(zhì)體-硅膠復(fù)合物孵育，獲得細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白-脂質(zhì)體-硅膠復(fù)合物；

以上步驟中保持細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白、脂質(zhì)體、硅膠的質(zhì)量比為1:(300～500):(700～900)；

或，

將摩爾比為(70～90):(10～30):(1～10)的二油酰基磷脂酰膽堿、二油酰基磷脂酰甘油、7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑基修飾的二油酰基磷脂酰乙醇胺混合，加入溶劑充分震搖使其溶解，除去溶劑，加入PBS以及FZD4蛋白充分震蕩重溶、孵育，超聲成囊泡狀，微孔濾膜過濾，獲得FZD4-脂質(zhì)體復(fù)合物；