[發明專利]用于檢測雞傳染性貧血病毒的引物對、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201910963417.0
• 申請日: 2019-10-11
• 公開（公告）號: CN110684866A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 李文鋒;黃淑堅;劉曉云;池仕紅;傅禹銘;李文俊;方煥新;黃惠蘭;曾繁聰;姜雪芹
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 44205 廣州嘉權專利商標事務所有限公司
• 代理人: 朱繼超

本發明公開了一種用于檢測雞傳染性貧血病毒的引物對、試劑盒和方法。該引物對包括SEQ ID NO.1所示的CIAV?F70和SEQ ID NO.2所示的CIAV?R70，該試劑盒包括上述的引物對、陽性標準質粒、實時熒光定量PCR試劑和ddH₂O，該方法以待測樣品為模板，使用該引物對進行熒光PCR擴增后根據標準曲線即可得到待測樣品中雞傳染性貧血病毒的含量，實現檢測的目的。本發明設計了一種針對CIAV的引物對，結合熒光PCR定量法能夠快速檢測CIAV，并提出了應用了該引物對的試劑盒，本發明提出的試劑盒和檢測方法準確度高、靈敏度高、特異型好且重復性好，能夠應用在CIAV的研究和防疫領域。

技術領域

本發明涉及雞傳染性貧血病毒(CIAV)的檢測技術領域，具體涉及用于檢測雞傳染性貧血病毒的引物對、試劑盒和方法。

背景技術

雞傳染性貧血病毒(CIAV)是一種類型獨特的環狀單鏈(負鏈)DNA病毒，根據CIAV病毒粒子大小及其核酸特征，1995年第六次國際病毒分類委員會(interenationalcommitteeon taxonomy of virus,ICTV)在維也納會議報告中將CIAV歸于圓環病毒科，圓環病毒屬(circovims)，與豬圓環病毒(porcine circovirus,PCV)和鸚鵡鳥曝羽病病毒(psittacine beak and feather disease virus,PBFDV)同屬一科。由于CIAV與其它兩種病毒在基因組及抗原結構方面存在一定差異，1999年ICTV在第八次病毒分類報告中，CIAV新增一個新屬，環形病毒屬(gyrovirus)，CIAV被單獨歸于新的環形病毒屬中，目前，CIAV是該屬的唯一成員。CIAV可通過水平和垂直傳播，所有天齡的雞均易感。

目前對于雞傳染性貧血的診斷方法主要是使用常規PCR檢測，常規PCR是分子水平上檢測的最原始的技術，該技術具有一定準確性，但其靈敏性明顯不足且重復性不好。因此，提出一種快速檢測CIAV的方法、試劑盒以及配套的引物對十分具有意義。

發明內容

本發明的目的在于提出一種用于檢測雞傳染性貧血病毒的引物對、試劑盒和方法，具有準確度高、靈敏度高和重復性好的特點。

為了實現上述目的，本發明采用以下的技術方案：

一種用于檢測雞傳染性貧血病毒的引物對，包括SEQ ID NO.1所示的CIAV-F70和SEQ ID NO.2所示的CIAV-R70。

本發明還提供了一種用于檢測雞傳染性貧血病毒的試劑盒，試劑盒包括：上述的引物對(CIAV-F70和CIAV-R70)、陽性標準質粒、SYBR Green Premix Pro Taq實時熒光定量PCR試劑和ddH₂O；所述陽性標準質粒是由SEQ ID NO.3所示的DNA片段與pMD18-T載體相連接后得到的重組質粒。

本發明還提供了一種用于檢測雞傳染性貧血病毒的方法，具體過程為：以待測樣品為模板，用上述的引物對進行實時熒光定量PCR擴增，得到待測樣品的循環閾值，再代入標準曲線得到待測樣品的雞傳染性貧血病毒的含量；所述標準曲線為Y＝-3.334lgX+39.08，其中Y為循環閾值，X為質粒的拷貝數。所述標準曲線是由10⁷、10⁶、10⁵、10⁴和10³copies/uL這5個梯度濃度的陽性質粒作為模板，用上述的引物對(CIAV-F70和CIAV-R70)進行實時熒光定量PCR擴增制得。根據標準曲線可知，當其Ct值(循環閾值)小于35、溶解曲線出現單一峰值且T_m(PCR產物打開雙鏈的溫度)值為80.5～81.5℃時，則判定待測樣品為陽性，其余情況則判定待測樣品為陰性。