[發明專利]臍血造血干細胞保存液及其制備方法有效
| 申請號： | 201910960663.0 | 申請日： | 2019-10-10 |
| 公開（公告）號： | CN110839612B | 公開（公告）日： | 2021-02-02 |
| 發明（設計）人： | 鄭春兵;王成;文樂;陳玲玲;王健 | 申請（專利權）人： | 湖南源品細胞生物科技有限公司 |
| 主分類號： | A01N1/02 | 分類號： | A01N1/02 |
| 代理公司： | 北京精金石知識產權代理有限公司 11470 | 代理人： | 張黎 |
| 地址： | 410100 湖南省長沙市長沙經濟*** | 國省代碼： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 造血 干細胞 保存 及其 制備 方法 | ||
1.一種臍血造血干細胞保存液，其特征在于：按重量份數計，原料包括：10-18份低分子右旋糖酐、6-18份二甲基亞砜、65-80份DMEM培養基、4-8份甘油、0.05-0.2份葉酸、0.1-0.5份甘露低聚糖和1-5份磷脂酰絲氨酸；
所述二甲基亞砜、甘露低聚糖和磷脂酰絲氨酸的重量比范圍為20-30:1:8-15；
所述臍血造血干細胞保存液的制備與預處理方法包括以下步驟：將配方用量二甲基亞砜、低分子右旋糖酐、DMEM培養基、甘油、葉酸、甘露低聚糖和磷脂酰絲氨酸混勻后，即得保存液，將保存液進行兩段變溫預處理，而后冷卻平衡，所述兩段變溫預處理包括第一段降溫處理與第二段升溫處理；
所述第一段降溫處理，處理溫度為-15~-8℃，處理時間為10-15min；所述第二段升溫處理，處理溫度為4℃，處理時間為5-10min。
2.根據權利要求1所述的臍血造血干細胞保存液，其特征在于：按重量份數計，原料包括：12-16份低分子右旋糖酐、8-15份二甲基亞砜、70-78份DMEM培養基、5-7份甘油、0.08-0.15份葉酸、0.2-0.4份甘露低聚糖和2-4份磷脂酰絲氨酸。
3.一種臍血造血干細胞的分離、培養和保存方法，其特征在于：包括以下步驟：
（1）臍血造血干細胞的分離與培養：
①采集臍血，向臍血中加入羥乙基淀粉沖洗并混勻，進行三次降溫離心，每一次降溫離心后均收集上層含有白細胞的血漿層，將三次降溫離心后收集到的血漿層混勻，經PBS緩沖液沖洗后得到造血干細胞；
②將DMEM培養基與羥乙基淀粉加入步驟①得到的造血干細胞中，混勻后沉降，取上清液吹打混勻，得到白細胞懸液；
③將DMEM培養基加入步驟②中的白細胞懸液中，調節白細胞終濃度為0.5×106/mL；
④將CFU-GM半固體培養基加入培養板內，培養板外圍加入生理鹽水，再將培養板放入CO2培養箱中靜置；
⑤將步驟③中調好濃度的白細胞懸液加入培養板中的CFU-GM半固體培養基中，將培養板放入CO2培養箱中培養后得到造血干細胞集落；
（2）保存液的制備與預處理：采用如權利要求1或2所述的臍血造血干細胞保存液的制備與預處理方法；
（3）造血干細胞的保存：將步驟（1）中的造血干細胞集落冷卻平衡后與保存液混勻。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟①中所述臍血與羥乙基淀粉的體積比為4:1。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟①中所述三次降溫離心的第一次降溫溫度為4-10℃，轉速為480rpm，時間為5-8min。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟①中所述三次降溫離心的第二次降溫離心和第三次降溫離心的溫度均為4-10℃，轉速均為1500rpm，時間均為4-6min。
7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（2）中所述冷卻平衡，時間為5-15min，溫度為4℃以下。
8.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（3）中所述冷卻平衡，時間為10-15min，溫度為4℃。
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