[發明專利]一種數字PCR檢測布魯氏菌核酸DNA的方法

在審

• 申請號: 201910955795.4
• 申請日: 2019-10-09
• 公開（公告）號: CN111733217A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 田國忠
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 張立改

1.一種數字PCR技術檢測布魯氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，配置PCR反應體系，經過預處理后，在一定的PCR反應條件下，使用PCR儀，進行PCR擴增，擴增結果使用微滴分析儀，進行分析判斷；所述PCR反應體系，包括：待檢樣品核酸DNA、2╳ddPCR Supermix、引物、探針和雙蒸餾水。

2.按照權利要求1所述的一種數字PCR技術檢測布魯氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，待檢測樣品核酸DNA為各種可用的試劑盒提取的核酸DNA。

3.按照權利要求1所述的一種數字PCR技術檢測布魯氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，引物和探針，根據布魯氏菌特異編碼bscp31蛋白基因的核苷酸序列，應用軟件分別設計布魯氏菌特異的引物和探針，其物核苷酸序列如下所示：

正向引物：F1：5’-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3’，SEQ ID NO：1；

反向引物：R1：5’-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3’，SEQ ID NO：2；

探針序列：Probe：5’-TGCCGTTATAGGCCCAATAGGCAACG-3’，SEQ ID NO：3，其中，5’端標記熒光基團FAM，3’端使標記淬滅基團BHQ-1。

4.按照權利要求1所述的一種數字PCR技術檢測布魯氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR反應體系包括：2╳ddPCR Supermix 10μL；待檢核酸DNA 1μL；正向引物F1和反向引物R1各1.6μL，探針Probe 0.8μL，補水至20μL。

5.按照權利要求4所述的一種數字PCR技術檢測布魯氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，引物和探針溶液的濃度皆為10μmol/L。

6.按照權利要求1所述的一種數字PCR技術檢測布魯氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR反應體系預處理過程如下：

(1)制備微滴：將20μL PCR反應體系和70μL的微滴生成油加入到微滴生成卡槽內，蓋上膠墊，放入微滴生成儀中產生微滴；

(2)封膜：將微滴生成儀中產生微滴約40μL，用移液槍轉移到96孔PCR板中，蓋上錫紙膜，用封膜儀將96孔PCR板封膜；

(3)將封膜的PCR板，放在PCR儀中運行。

7.按照權利要求6所述的一種數字PCR技術檢測布魯氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，數字PCR擴增條件為：95℃預變性10min；95℃變性30s，退火溫度59℃，1min，循環40次；98℃酶失活10min。

8.按照權利要求6所述的一種數字PCR技術檢測布魯氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR擴增結果使用微滴分析儀，進行分析判斷，將96孔PCR板放在微滴分析儀中讀取熒光信號，通過軟件對結果進行分析，陽性對照和陰性對照成立的前提下，計數陽性微滴數，即核酸DNA的拷貝數。