[發(fā)明專(zhuān)利]用于切割靶DNA 的組合物及其用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910950859.1
• 申請(qǐng)日: 2013-10-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110669746A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金進(jìn)秀;曹承于;金素貞;J·M·金;金爽中
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 基因工具股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/22
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/22;C12N15/113;C12N15/55;C12N5/10;C12N15/82
• 代理公司: 11247 北京市中咨律師事務(wù)所
• 代理人: 陳迎春;黃革生

1.用于在植物細(xì)胞中切割靶DNA的II型成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR-相關(guān)蛋白質(zhì)9(Cas9)組合物，其中所述靶DNA是內(nèi)源DNA，優(yōu)選基因組DNA，其中所述組合物包含：

(a)編碼CRISPR-相關(guān)蛋白質(zhì)9(Cas9)多肽的核酸，或者Cas9多肽；和

(b)特異于靶DNA的向?qū)NA，

其中該向?qū)NA是：

(i)dual向?qū)NA，其包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)；或者

(ii)單鏈向?qū)NA，其包含融合至反式激活crRNA(tracrRNA)的CRISPR RNA(crRNA)。

2.權(quán)利要求1的II型CRISPR/Cas9組合物，其中所述組合物包含兩種向?qū)NA，每種向?qū)NA特異于靶DNA的其中一條鏈，且其中所述Cas9多肽是Cas9切口酶。

3.植物細(xì)胞，其包含(i)靶DNA，其中所述靶DNA是內(nèi)源DNA，和(ii)權(quán)利要求1或2的II型CRISPR/Cas9組合物。

4.包含權(quán)利要求3的植物細(xì)胞或者由權(quán)利要求3的植物細(xì)胞再生的植物。

5.在植物細(xì)胞中切割靶DNA的方法，其中所述靶DNA是內(nèi)源DNA，優(yōu)選基因組DNA，所述方法包括向植物細(xì)胞引入：

(a)編碼CRISPR-相關(guān)蛋白質(zhì)9(Cas9)多肽的核酸，或者Cas9多肽；和

(b)特異于靶DNA的向?qū)NA，

其中該向?qū)NA是：

(i)dual向?qū)NA，其包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)；或者

(ii)單鏈向?qū)NA，其包含融合至反式激活crRNA(tracrRNA)的CRISPR RNA(crRNA)。

6.在植物細(xì)胞的靶DNA的不同鏈中引入兩個(gè)缺口的方法，其中所述靶DNA是內(nèi)源DNA，優(yōu)選基因組DNA，所述方法包括向植物細(xì)胞引入：

(a)編碼CRISPR-相關(guān)蛋白質(zhì)9(Cas9)多肽的核酸，或者Cas9多肽，其中所述Cas9多肽是Cas9切口酶；和

(b)兩種向?qū)NA，其中所述兩種向?qū)NA的每一種特異于靶DNA的一條鏈。

其中該向?qū)NA是：

(i)dual向?qū)NA，其包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)；或者

(ii)單鏈向?qū)NA，其包含融合至反式激活crRNA(tracrRNA)的CRISPR RNA(crRNA)。

7.權(quán)利要求6的方法，其中所述兩個(gè)缺口分開(kāi)至少100個(gè)堿基對(duì)。

8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述引入通過(guò)轉(zhuǎn)染完成，可選的所述轉(zhuǎn)染通過(guò)微注射、電穿孔、DEAE-葡聚糖處理、脂轉(zhuǎn)染、納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒介導(dǎo)的基因遞送或者聚乙二醇(PEG)-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)行。

9.權(quán)利要求8的方法，其中所述PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染包含在40％PEG轉(zhuǎn)染緩沖液中轉(zhuǎn)染，其中所述40％PEG轉(zhuǎn)染緩沖液優(yōu)選地包含40％PEG4000，200mM甘露糖醇和100mMCaCl₂。

10.權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述是(a)和(b)的共轉(zhuǎn)染或順序轉(zhuǎn)染，可選的其中該順序轉(zhuǎn)染是先轉(zhuǎn)染(a)后轉(zhuǎn)染(b)。

11.用于在植物細(xì)胞中切割靶DNA的試劑盒，其包含權(quán)利要求1或2的組合物。

12.權(quán)利要求1或2的II型CRISPR/Cas9組合物，權(quán)利要求3的植物細(xì)胞，權(quán)利要求4的植物，權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的方法，或者權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述Cas9蛋白質(zhì)來(lái)自鏈球菌屬，優(yōu)選化膿性鏈球菌。