[發明專利]適用于超微量DNA測序的接頭及其應用

有效

• 申請號: 201910943322.2
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN110643680B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 張曉妮;許明炎
• 申請（專利權）人: 深圳市海普洛斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/11;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 深圳舍穆專利代理事務所(特殊普通合伙) 44398
• 代理人: 邱爽

1.一種DNA測序的接頭，其特征在于，

包括從5’端到3’端依次連接的Tag序列、PolyN序列、第一發夾互補序列、第一發夾結構序列、dUTP、第二發夾結構序列、以及與所述第一發夾互補序列形成反向互補序列的第二發夾互補序列，所述接頭的5’端具有磷酸化標記；

其中，所述接頭被形成為所述第一發夾互補序列與所述第二發夾互補序列配對的發夾結構，所述第二發夾結構序列的長度大于所述第一發夾結構序列的長度；所述Tag序列用于進行定位，確定分子標記的起始位置，長度在3-4bp；所述PolyN序列為6-12bp的隨機序列，用于進行單分子編碼。

2.根據權利要求1所述的接頭，其特征在于，

還包括布置在所述第一發夾互補序列與所述第一發夾結構序列之間的第一索引序列。

3.根據權利要求1或2所述的接頭，其特征在于，

還包括布置在所述第二發夾結構序列與所述第二發夾互補序列之間的第二索引序列。

4.一種ctDNA測序文庫構建的方法，其特征在于，

包括以下步驟：

（a）準備具有從5’端到3’端依次連接的Tag序列、PolyN序列、第一發夾互補序列、第一發夾結構序列、dUTP、第二發夾結構序列、以及與所述第一發夾互補序列形成反向互補序列的第二發夾互補序列的接頭，所述接頭的5’端具有磷酸化標記，并進行退火，形成發夾結構；其中，所述第二發夾結構序列的長度大于所述第一發夾結構序列的長度；所述Tag序列用于進行定位，確定分子標記的起始位置，長度在3-4bp；所述PolyN序列為6-12bp的隨機序列，用于進行單分子編碼；

（b）將步驟（a）的形成發夾結構的接頭與提取的循環腫瘤DNA（ctDNA）進行連接；

（c）采用dUTP識別酶對步驟（b）的產物進行酶切；并且

（d）對酶切產物進行PCR擴增，獲得ctDNA測序文庫。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：

在所述步驟（d）中，采用針對所述第一發夾結構序列的上游引物和針對所述第二發夾結構序列設計的下游引物對所述酶切產物進行PCR擴增。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：

所述上游引物為Seq?ID?No.5所示序列，所述下游引物為Seq?ID?No.6所示序列；

Seq?ID?No.5：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3’

Seq?ID?No.6：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGTGACTGGAG-3’。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，

在所述步驟（a）中，對所述接頭進行梯度退火，以使所述接頭形成發夾結構。

8.一種ctDNA測序文庫，其特征在于，是使用根據權利要求4-7任一項所述的方法構建的ctDNA測序文庫。