[發明專利]一種用于轉座酶片段化的試劑及其應用

在審

• 申請號: 201910940371.0
• 申請日: 2019-09-30
• 公開（公告）號: CN110564705A
• 公開（公告）日: 2019-12-13
• 發明（設計）人: 張惠丹;戴敬;楊晟;黎晗
• 申請（專利權）人: 蘇州璞瑞卓越生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C40B50/06;C12Q1/6806
• 代理公司: 32256 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 王茹;王鋒

本發明公開了一種用于轉座酶片段化的試劑，其包括獨立包裝的如下組件：Tn5轉座酶、第一接頭、第二接頭以及轉座反應緩沖液。進一步的，所述試劑還包括獨立包裝的正向引物的集合、反向引物的集合、DNA聚合酶、DNA聚合酶反應緩沖液，以及片段化反應緩沖液、終止溶液等組件。本發明還提供了包括所述試劑的試劑盒。本發明提供的試劑及試劑盒便于使用，成本低廉，既可避免現有商品化轉座體系穩定性差、用途單一、成本高昂等缺陷，而且使用靈活性好，適應多種實際需求。特別是，利用所述試劑及試劑盒進行片段化核酸文庫的構建時，僅需10min即可完成DNA片段化、末端修復和接頭連接過程，可以顯著縮短建庫時間，并獲得優異的測序質量。

技術領域

本發明涉及一種試劑盒，特別涉及一種用于轉座酶片段化的試劑及試劑盒，屬于分子生物學設備技術領域。

背景技術

傳統建庫流程繁瑣，一般要經過以下幾個步驟：(1)將待測序的DNA分子用超聲波打碎；(2)將打碎后的基因組進行末端補平；(3)在補平后的片段3’端加A和5’端進行磷酸化；(4)對修復后的片段進行接頭連接；(5)對接頭連接后DNA片段進行PCR擴增；(6)對擴增后的文庫進行磁珠純化。

轉座法建庫相對于傳統建庫，其實驗方法簡單快速，將DNA片段化、末端修復和接頭連接過程集中于一個體系完成，最快5分鐘內即可同時完成DNA片段化和接頭連接，而且所需要的DNA量少。然而目前市面上能提供的Tn5轉座法建庫試劑盒普遍存在只適用于文庫構建，適用范圍單一，且采購成本相對較高，預定周期較長等缺陷。

例如，Illumina公司提供的商品化轉座體系包括由轉座酶和兩種等摩爾的接頭(Adapter)1、2構成一個完整轉座子的mix體系，價格昂貴，且專為Illumina高通量測序平臺而開發，用途單一。

此外，現有的商品化試劑盒直接提供轉座復合物(Transposome)，轉座體穩定性較差，運輸過程中劇烈震動顛簸可能都會導致接頭脫落，導致片段化效果下降影響最終文庫質量和產量。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種用于轉座酶片段化的試劑及其應用，以解決現有技術中存在的問題。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案包括：

本發明實施例提供了一種用于轉座酶片段化的試劑，其包括獨立包裝的如下組件：Tn5轉座酶、第一接頭、第二接頭以及轉座體緩沖液，所述Tn5轉座酶的序列如SEQ IDNO.1所示，所述第一接頭的序列如SEQ ID NO.2～3所示，所述第二接頭的序列如SEQ IDNO.4～5所示。

進一步的，所述試劑還包括獨立包裝的正向引物的集合、反向引物的集合、擴增酶、擴增反應緩沖液。

進一步的，所述試劑還包括獨立包裝的片段化反應緩沖液、終止溶液中的任意一種或多種。

本發明實施例提供了一種試劑盒，其包括前述的任一種試劑。

本發明實施例提供了一種片段化核酸文庫的構建方法，其包括：

將Tn5轉座酶、第一接頭、第二接頭于轉座反應緩沖液中混合，并在室溫下孵育30～120min，獲得轉座子復合物，之后進行純化處理，其中所述Tn5轉座酶的序列如SEQ IDNO.1所示，所述第一接頭的序列如SEQ ID NO.2～3所示，所述第二接頭的序列如SEQ IDNO.4～5所示；

將純化后的轉座子復合物、人類基因組DNA與片段化反應緩沖液、超純水混合，并在50～60℃孵育3～15min，取出冰水浴降溫1～2min，之后加入終止溶液50～60℃孵育3～7min終止反應，獲得片段化產物；

之后將片段化產物與正向引物的集合、反向引物的集合、擴增酶、擴增反應緩沖液混合，并進行PCR反應，獲得富集的DNA片段。