[發明專利]差異代理技術在C·T堿基替換細胞富集中的應用有效
| 申請號： | 201910938686.1 | 申請日： | 2019-09-30 |
| 公開（公告）號： | CN110564752B | 公開（公告）日： | 2021-07-16 |
| 發明（設計）人： | 楊進孝;徐雯;楊永星;康桂婷;武瑩;李璐 | 申請（專利權）人： | 北京市農林科學院 |
| 主分類號： | C12N15/65 | 分類號： | C12N15/65;C12N15/82 |
| 代理公司： | 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 | 代理人： | 關暢 |
| 地址： | 100097 北京市海淀區曙*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 差異 代理 技術 堿基 替換 細胞 富集 中的 應用 | ||
1.成套試劑，其包括sgRNA或與所述sgRNA相關的生物材料、C·T堿基替換系統和功能喪失的篩選劑抗性基因或與所述功能喪失的篩選劑抗性基因相關的生物材料；
所述sgRNA由靶向目標基因靶點序列的esgRNA和靶向所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列的sgRNA組成；
所述靶向目標基因靶點序列的esgRNA結構如下：所述目標基因靶點序列轉錄的RNA-esgRNA骨架；
所述靶向所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列的sgRNA結構如下：所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列轉錄的RNA-sgRNA骨架；
所述C·T堿基替換系統包括Cas9核酸酶或與所述Cas9核酸酶相關的生物材料和胞嘧啶脫氨酶或與所述胞嘧啶脫氨酶相關的生物材料；
所述C·T堿基替換系統在靶向所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列的sgRNA的向導下，可通過對所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列進行C·T堿基替換使所述功能喪失的篩選劑抗性基因功能恢復；
所述sgRNA骨架為將序列1第571-646位中的T替換為U得到的RNA分子；
所述esgRNA骨架為將序列11中的T替換為U得到的RNA分子；
與所述sgRNA相關的生物材料為編碼所述sgRNA的核酸分子或含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物、轉基因細胞系；
與所述功能喪失的篩選劑抗性基因相關的生物材料為編碼所述功能喪失的篩選劑抗性基因的核酸分子或含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物、轉基因細胞系；
與所述Cas9核酸酶相關的生物材料為編碼所述Cas9核酸酶的核酸分子或含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物、轉基因細胞系；
與所述胞嘧啶脫氨酶相關的生物材料為編碼所述胞嘧啶脫氨酶的核酸分子或含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物、轉基因細胞系；
所述功能喪失的篩選劑抗性基因為將篩選劑抗性基因的起始密碼子刪除，且在篩選劑抗性基因5’端添加代理靶點靶序列后得到的序列；所述C·T堿基替換系統在靶向所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列的sgRNA的向導下，可通過對所述代理靶點靶序列進行C·T堿基替換使所述功能喪失的篩選劑抗性基因功能恢復；
所述代理靶點靶序列為序列1第11305-11327位或序列10；
所述篩選劑抗性基因為外源抗性基因。
2.根據權利要求1所述的成套試劑，其特征在于：所述篩選劑抗性基因為潮霉素抗性基因。
3.根據權利要求1所述的成套試劑，其特征在于：所述sgRNA為前體tRNA-sgRNA；所述前體tRNA-sgRNA由靶向目標基因靶點序列的前體tRNA-esgRNA和靶向所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列的前體tRNA-sgRNA組成；
所述靶向目標基因靶點序列的前體tRNA-esgRNA結構如下：前體tRNA-所述目標基因靶點序列轉錄的RNA-esgRNA骨架；
所述靶向所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列的前體tRNA-sgRNA結構如下：前體tRNA-所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列轉錄的RNA-sgRNA骨架；
所述前體tRNA為將序列1第474-550位中的T替換為U得到的RNA分子。
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