[發明專利]差異代理技術在A·G堿基替換細胞富集中的應用

有效

• 申請號: 201910938672.X
• 申請日: 2019-09-30
• 公開（公告）號: CN110669775B
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 楊進孝;趙久然;張成偉;徐雯;武瑩;呂欣欣
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/66;C12N15/82;C12N9/22
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.成套試劑，其包括sgRNA、A·G堿基替換系統和功能喪失的篩選劑抗性基因或與所述功能喪失的篩選劑抗性基因相關的生物材料；

所述sgRNA由靶向目標基因靶點序列的esgRNA和靶向所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列的sgRNA組成；

所述靶向目標基因靶點序列的esgRNA結構如下：所述目標基因靶點序列轉錄的RNA-esgRNA骨架；

所述靶向所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列的sgRNA結構如下：所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列轉錄的RNA-sgRNA骨架；

所述sgRNA骨架為序列1第2418-2493位中的T替換為U得到的RNA分子；

所述esgRNA骨架為序列1第617-702位中的T替換為U得到的RNA分子；

所述A·G堿基替換系統包括Cas9核酸酶或與所述Cas9核酸酶相關的生物材料和腺嘌呤脫氨酶或與所述腺嘌呤脫氨酶相關的生物材料；

與所述Cas9核酸酶相關的生物材料為編碼所述Cas9核酸酶的核酸分子或含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物、轉基因細胞系；

與所述腺嘌呤脫氨酶相關的生物材料為編碼所述腺嘌呤脫氨酶的核酸分子或含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物、轉基因細胞系；

所述篩選劑抗性基因為外源抗性基因；

與所述功能喪失的篩選劑抗性基因相關的生物材料為編碼所述功能喪失的篩選劑抗性基因的核酸分子或含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物、轉基因細胞系；

所述功能喪失的篩選劑抗性基因為將篩選劑抗性基因的起始密碼子刪除，且在篩選劑抗性基因5’端添加代理靶點靶序列后得到的序列；所述A·G堿基替換系統在靶向所述功能喪失的篩選劑抗性基因靶點序列的sgRNA的向導下，可通過對所述代理靶點靶序列進行A·G堿基替換使所述功能喪失的篩選劑抗性基因功能恢復；

所述代理靶點靶序列為序列5。

2.根據權利要求1所述的成套試劑，其特征在于：所述篩選劑抗性基因為潮霉素抗性基因。

3.根據權利要求1所述的成套試劑，其特征在于：所述Cas9核酸酶為SpCas9n蛋白質；

所述腺嘌呤脫氨酶為ecTadA蛋白質；

所述SpCas9n蛋白質為序列3所示的蛋白質；

與所述SpCas9n相關的生物材料為B1）至B5）中的任一種：

B1）編碼所述SpCas9n的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表達盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重組載體、或含有B2）所述表達盒的重組載體；

B4）含有B1）所述核酸分子的重組微生物、或含有B2）所述表達盒的重組微生物、或含有B3）所述重組載體的重組微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的轉基因細胞系、或含有B2）所述表達盒的轉基因細胞系；

所述ecTadA蛋白質為序列2所示的蛋白質；

與所述ecTadA蛋白質相關的生物材料為F1）至F5）中的任一種：

F1）編碼所述ecTadA蛋白質的核酸分子；

F2）含有F1）所述核酸分子的表達盒；

F3）含有F1）所述核酸分子的重組載體、或含有F2）所述表達盒的重組載體；

F4）含有F1）所述核酸分子的重組微生物、或含有F2）所述表達盒的重組微生物、或含有F3）所述重組載體的重組微生物；

F5）含有F1）所述核酸分子的轉基因細胞系、或含有F2）所述表達盒的轉基因細胞系。

4.權利要求1-3任一所述的成套試劑在M1）-M6）任一種中的應用：

M1）富集生物體或生物細胞基因組靶點序列發生A·G堿基替換的細胞；

M2）制備富集生物體或生物細胞基因組靶點序列發生A·G堿基替換的細胞的產品；

M3）提高生物體或生物細胞基因組靶點序列的A·G堿基替換效率；

M4）制備提高生物體或生物細胞基因組靶點序列的A·G堿基替換效率的產品；

M5）生物體或生物細胞基因組靶點序列中的A·G堿基替換；

M6）制備生物體或生物細胞靶點序列中的A·G堿基替換的產品。