[發(fā)明專利]一種利用懸浮細(xì)胞系制備塞內(nèi)卡病毒的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910933902.3
• 申請(qǐng)日: 2019-09-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110564698B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭海學(xué);曹偉軍;楊帆;朱紫祥;魏婷;鄭敏;蔣保余;田宏;張克山;劉永杰;茹毅;黨文;劉湘濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N7/00
• 分類(lèi)號(hào): C12N7/00;C12N5/071
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 呂紀(jì)濤

本發(fā)明提供了一種使用懸浮細(xì)胞系制備塞內(nèi)卡病毒的方法，所述方法包括如下步驟：(1)將貼壁的ST細(xì)胞系馴化為懸浮ST?S細(xì)胞系；(2)使用步驟(1)得到的懸浮ST?S細(xì)胞系培養(yǎng)制備塞內(nèi)卡病毒。本發(fā)明通過(guò)采用馴化得到的懸浮ST?S細(xì)胞系進(jìn)行塞內(nèi)卡病毒的培養(yǎng)，有效提高了所得病毒的產(chǎn)能，為規(guī)模化大量生產(chǎn)塞內(nèi)卡疫苗奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用懸浮細(xì)胞系制備塞內(nèi)卡病毒的方法，特別涉及一種利用懸浮培養(yǎng)傳代細(xì)胞系制備塞內(nèi)卡病毒的方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

塞內(nèi)卡病毒A(SenecavirusA,SVA)，也稱塞內(nèi)卡病毒(Senecavalleyvirus,SVV)，是全球新發(fā)和新傳入我國(guó)的病毒，是小RNA病毒科新增的塞內(nèi)卡病毒屬的唯一成員，感染豬引起豬鼻鏡及蹄冠處出現(xiàn)水皰、潰爛，從而導(dǎo)致跛行，臨床癥狀與口蹄疫難以區(qū)分。2014年之前，SVA僅在美國(guó)和加拿大零星發(fā)生，但自2015年以來(lái)，巴西、美國(guó)、泰國(guó)、中國(guó)等陸續(xù)出現(xiàn)SVA疫情，并不斷蔓延，危害加重。自從2015年SVA傳入我國(guó)以來(lái)，先后在廣東、湖北、黑龍江、福建、廣西、河南、河北、山東、遼寧、安徽、浙江、江西、四川和陜西等多省發(fā)生疫情，不斷流行和蔓延，致病性增強(qiáng)，且2017年之后新分離毒株與以往毒株相比發(fā)生部分氨基酸變異，危害加重，嚴(yán)重干擾口蹄疫防控。因其暫沒(méi)有商品化的疫苗，一旦發(fā)生SVA疫情，很難進(jìn)行有效的控制，成為全球急需解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種利用懸浮培養(yǎng)傳代細(xì)胞系制備塞內(nèi)卡病毒的方法。采用該方法制備塞內(nèi)卡病毒實(shí)現(xiàn)了懸浮培養(yǎng)塞內(nèi)卡病毒和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)塞內(nèi)卡疫苗的技術(shù)突破，采用該方法培養(yǎng)塞內(nèi)卡病毒有效提高了所得病毒的產(chǎn)能、病毒滴度和質(zhì)量穩(wěn)定均一性，減少了批次間差異，為加速規(guī)模化生產(chǎn)懸浮制備塞內(nèi)卡疫苗奠定了基礎(chǔ)。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種使用懸浮細(xì)胞系制備塞內(nèi)卡病毒的方法，其中所述方法包括如下步驟：

(1)將貼壁的ST細(xì)胞系馴化為懸浮ST-S細(xì)胞系；

(2)使用步驟(1)得到的所述懸浮ST-S細(xì)胞系制備塞內(nèi)卡病毒。

在某些實(shí)施方式中，“貼壁的ST細(xì)胞系”指的是貼壁ST細(xì)胞系。在某些實(shí)施方式中，所述貼壁的ST細(xì)胞系可以通過(guò)市售購(gòu)得。在某些實(shí)施方式中，所述貼壁的ST細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)，ATCC編號(hào)為CRL-1746。

本發(fā)明所述的塞內(nèi)卡病毒可以是從田間分離純化獲得的塞內(nèi)卡病毒，也可以是通過(guò)基因工程方法獲得的重組塞內(nèi)卡病毒株，還可以是其它表達(dá)系統(tǒng)(工程菌、昆蟲(chóng)、植物)制備的類(lèi)病毒顆粒、重組抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的基因工程方法獲得重組塞內(nèi)卡病毒株或者塞內(nèi)卡病毒片段，參見(jiàn)，例如，http://www.science.gov/topicpages/v/virus+vaccine+development.html中所描述的。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的塞內(nèi)卡病毒為塞內(nèi)卡病毒SVV/FJ/001株，其微生物保藏號(hào)為：CCTCCNO:V201802。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的塞內(nèi)卡病毒選自下組：SVVCH-HN株、SVVCH-HNSL株、SVVCH-GD株、SVVCH-01-2015株、SVVCH-04-2015株、SVVCH-DB-11-2015株、SVVCH-DL-01-2016株、SVVCH-ZW-01-2016株、SVVHB-CH-2016株、SVVKS15-01株、SVV-001株和SVVColombia/2016株。

在某些實(shí)施方式中，所述步驟(1)中的馴化包括如下步驟：

(a)將所述貼壁的ST細(xì)胞系與含有第一濃度胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基一起進(jìn)行培養(yǎng)直至長(zhǎng)滿培養(yǎng)容器；

(b)將步驟(a)中得到的細(xì)胞傳代培養(yǎng)，然后用胰蛋白酶消化，得到的細(xì)胞用低血清懸浮培養(yǎng)基和含有第二濃度胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基混合稀釋至細(xì)胞密度為0.5～1.0×10⁶cell/ml，在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2～5代；