[發明專利]使用柑橘衰退病毒載體進行外源基因表達

有效

• 申請號: 201910930391.X
• 申請日: 2012-09-21
• 公開（公告）號: CN110734928B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 威廉·歐·多森;斯維特拉娜·弗里莫諾娃;卓阿·埃爾默塔
• 申請（專利權）人: 佛羅里達大學研究基金會有限公司
• 主分類號: C12N15/83
• 分類號: C12N15/83;A01H5/00;A01H6/78;A01H6/82
• 代理公司: 南京蘇創專利代理事務所(普通合伙) 32273
• 代理人: 常曉慧

本發明揭示了基于對柑橘衰退病毒的修改、為有益目的用于轉染柑橘樹的病毒載體。本發明揭示了包括含有一個或多個編碼異源性多肽的基因盒的病毒載體。所述基因盒位于病毒基因組上的理想位點，使得增加表達量的同時保存病毒的功能性。本發明同時揭示了用病毒載體轉染植物的方法以及被病毒轉染的植物的實施例。

相關申請的交叉參考

本申請根據美國法典第35篇第119條(35?USC?119)要求2011年9月21日提交的美國專利申請第61/537,154號的優先權，并通過引用將其納入本文中。

背景技術

病毒載體的早期開發目的是廉價生產該領域可等比擴大的專門蛋白。最初使用的是一種植物病毒載體，即一種雙鏈DNA病毒花椰菜花葉病毒(Brisson?et?al.，1984；Gronenborn?et?al.，1981)。然而，這種病毒穩定性過低，因而無法使用(Fütterer?et?al.，1990)。反向遺傳學系統的發展使得RNA病毒也能夠被利用，載體的開發有了更多選擇(Ahlquist?et?al.，1984)。

病毒載體是基礎研究的重要元素，有巨大的商業應用潛力。但外源插入物質穩定性不高是病毒載體用于應用領域蛋白表達商業化的一個主要缺點。

發明內容

本申請是基于多項探索利用CTV載體表達806到3480個核苷酸外源基因的局限性研究。在一個實施例中，基因盒被引入CTV基因組中以替換p13基因。在其他實施例中，基因被插入在不同位點(例如，p13-p20、p20-p23和p23-3’NTR(非轉錄區))。在另一個實施例中，檢測了p23融合與蛋白酶加工的作用。在可替代的實施例中，基因被插入在IRES序列后來創建雙順反子信息。

27個表達載體被創造并在本生煙原生質體和植物中進行檢測。值得注意的是，這里介紹的多數新開發出的載體結構在植物中復制、系統地播散，產生外源基因。檢測到的表達量最大的載體包括p13-p20或p23-3’NTR的“添加基因”結構。類似地，插入基因取代p13基因的載體有效地表達了不同的報告基因。然而，報告基因的最優表達取決于插入基因的大小和部位。表達最優的小基因為靠近3’端處的基因，而表達最優的大基因來自多個內部位點。

在本生煙和柑橘上都實現了相同載體上兩種基因的同時有效表達。本文介紹的新CTV載體的基因組有獨特的彈性結構，能夠通過多種方法容納并表達外源基因。

對一種有效的載體進行基因工程處理需要平衡不同因素。載體需要精心設計，讓植物中的復制和系統轉移最小化，同時外源蛋白的表達最大化(Shivprasad?et?al.，1999)。最后一個因素是載體的穩定性。簡言之，載體的有用性直接與其穩定性相關。穩定性是載體減少重組、提高競爭力的結果，所產生的重組體丟失部分或全部插入序列。

附圖說明