[發明專利]嵌合裂解酶ILTphg和編碼此酶的多核苷酸

有效

• 申請號: 201910923094.2
• 申請日: 2019-09-27
• 公開（公告）號: CN110592057B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發明（設計）人: 林連兵;劉曉航;蔡賽波;鄧先余;王峰;張棋麟;郭軍
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/62;C12N15/60;A61P31/04;A01P1/00
• 代理公司: 昆明人從眾知識產權代理有限公司 53204
• 代理人: 沈艷尼

本發明公開了一種嵌合裂解酶ILTphg和編碼此酶的多核苷酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；將該嵌合裂解酶應用在抑制或殺滅革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陽性菌中，實驗結果顯示其能夠抑制革蘭氏陽性和陰性細菌的生長，其在30~50℃范圍內具有催化活性，其核苷酸序列可用于構建生產此裂解酶的基因工程菌株且適于工業化生產。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種嵌合裂解酶ILTphg，以及編碼此酶的核酸序列。

背景技術

近年來，隨著抗生素大量濫用，出現了很多耐藥性菌株帶來的各種問題，人們迫切需要研究新型的抗菌試劑，其中裂解酶作為新型抗菌制劑，能夠對細菌進行防治、治療并具有獨特的優點。首先，噬菌體裂解酶不會對動物產生毒副作用，因為它只能作用于病原菌宿主而對其他細菌不產生作用。其次，噬菌體裂解酶的催化結構作用于病原宿主菌的細胞壁肽聚糖，病菌對它不會產生耐藥性，同時能夠與抗生素聯合用藥，共同發揮作用。

然而，天然噬菌體裂解酶存在以下問題。首先，革蘭氏陰性菌胞壁肽聚糖外的一層外膜有效的阻擋裂解酶進入宿主細胞壁上發揮作用。因此，在體外，大多數噬菌體裂解酶不能裂解陰性細菌，限制了裂解酶用于治療陰性細菌導致的感染。其次，噬菌體裂解酶的種屬特異性，也在一定程度上限制了其在臨床上的應用，需要發展抗菌活性高，較為廣譜的裂解酶；最后一些裂解酶在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達時，表現出表達量低，可溶性差等問題。可見，這些問題亟待解決，以適應未來發展噬菌體裂解酶抗菌藥物的需要。

基于結構上的模塊化特點，構建嵌合裂解酶是一種有效解決以上噬菌體裂解酶問題的方法。模塊化的裂解酶由兩種結構域組成，分別是與底物結合的細胞壁結合域（cellwall binding domain，CBD）和水解底物的EAD，或將催化域與其他結構域組合所得到的重組裂解酶。發展嵌合裂解酶可以使全酶具有更好的性質，如具有更強的殺滅陰性細菌的活性，更廣的裂解譜，更好的水溶性等。

大部分嵌合裂解酶的表達都采用多個啟動子啟動多個基因的辦法，而這種方法可能會導致某一種裂解酶表達量過低，而不能達到良好的殺菌效果。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本發明提供了一種嵌合裂解酶ILTphg，其是由亞棲熱菌（Meiothermust）TG07噬菌體MMP7的裂解酶MMPphg與棲熱菌（Thermus）TC16的噬菌體TSP裂解酶TSP-2phg以及連接兩個裂解酶的一條linker組成，該結構可以使翻譯出來的兩個蛋白質保持原有的空間結構，不改變其空間構型，從而保持其結合位點不會發生變化，不會對其酶活性產生影響；linker的分子量很小，通過設計引物利用PCR技術將其連接到裂解酶基因上；該嵌合裂解酶ILTphg的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或具有與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少90％的相同性的多肽、類似物或衍生物；其中裂解酶MMPphg的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，裂解酶TSP-2phg的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本發明另一目的是提供編碼上述嵌合裂解酶ILTphg的多核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；或其互補序列，或具有與SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列至少80％相同性的多核苷酸及其互補序列；該序列由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8組成。

上述嵌合裂解酶ILTphg能夠抑制革蘭氏陽性和陰性細菌的生長，其在30~50℃范圍內具有催化活性，以及良好的水溶性，并且具有更廣的裂解譜、更好的殺菌活性。

本發明的有益效果：

本發明提供的嵌合裂解酶能高效裂解細菌，可以抑制細菌的生長，使其有望取代傳統的抗生素藥物，其也可作為抑菌劑用于環境的殺菌。