[發(fā)明專利]一種檢測外泌體的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910909724.0
• 申請日: 2019-09-25
• 公開（公告）號: CN112557649A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 丁小梅
• 申請（專利權）人: 深圳光彩生命工程技術有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531;G01N23/04;G01N23/20;G01N23/20008
• 代理公司: 北京中仟知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11825
• 代理人: 田江飛

1.一種檢測外泌體的方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1、采集外泌體的樣本，提取細胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，通過離心的方式去除胞外基質(zhì)中的細胞雜質(zhì)，得到外泌體和分析液，提取分析液存儲在試管內(nèi)，用于對分析液的檢測，再提取外泌體儲存在培養(yǎng)基內(nèi)，用于對外泌體的檢測；

S2、外泌體的預處理，通過利用不同截留的相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜對培養(yǎng)基內(nèi)的外泌體進行選擇性分離，從而獲得預處理后的外泌體；

S3、外泌體的處理，將分離后的外泌體的表面，用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來，從而去除外泌體內(nèi)的雜質(zhì)，再取出上清后，進行超聲破碎處理；

S4、外泌體的檢測，超聲破碎后的外泌體，首先與核酸適體進行特異性結合，再將核酸適體的嵌合體修飾到外泌體表面，而嵌合體部分則作為開關引發(fā)兩條單鏈反應，獲得納米組裝體，再由動態(tài)光散射對納米組裝體上的靶細胞所分泌的外泌體表面進行原位組裝，再對形成原位組裝的外泌體配合透射電子顯微鏡進行檢測，達到外泌體的檢測效果。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測外泌體的方法，其特征在于：步驟S1中，所述在外泌體儲存在培養(yǎng)基內(nèi)之前，通過電鏡對外泌體進行觀察。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測外泌體的方法，其特征在于：步驟S3中，所述離心去除胞外基質(zhì)中細胞雜質(zhì)的離心時間為10-12min，去除大直徑多囊泡體的離心時間為35-45min，并且離心旋轉(zhuǎn)為8000r/min-12000r/min。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測外泌體的方法，其特征在于：步驟S3中，所述上清與含1％脫脂奶的PBS按照體積比1:29進行稀釋，然后進行超聲破碎，所述超聲破碎條件為間隔5s開關一次，至少60循環(huán)。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測外泌體的方法，其特征在于：步驟S4中，所述核酸適體的嵌合體在溫度為10-15℃的環(huán)境下修飾到外泌體表面。