[發(fā)明專利]一種基于臺(tái)蘑香蕈子實(shí)體干品的菌種分離純化和鑒定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910909595.5
• 申請(qǐng)日: 2019-09-25
• 公開（公告）號(hào): CN110577900A
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王術(shù)榮;常明昌;劉靖宇;孟俊龍;徐麗婧;耿雪冉;程艷芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12N1/02;C12Q1/6806;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 14121 太原萬惟新致知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)
• 代理人: 黃海燕

1.一種基于臺(tái)蘑香蕈子實(shí)體干品的菌種分離純化和鑒定方法，其特征在于：是通過如下步驟實(shí)現(xiàn)的：

（1）制作抑菌培養(yǎng)基：將1-正丁胺基甲酰-2-苯并咪唑-氨基甲酸甲酯溶于無菌水中，得到苯菌靈溶液，然后向經(jīng)55~65℃預(yù)熱融化的PDA培養(yǎng)基中加入苯菌靈溶液，再在無菌條件下倒平板制成抑菌用Be培養(yǎng)基；

（2）配制梯度孢子懸液：先將臺(tái)蘑香蕈干子實(shí)體的菌褶組織用0.1 mol/L的焦磷酸鈉溶液漂洗8~12s后，用將焦磷酸鈉溶液吸出，然后用無菌水浸洗8~12s后將無菌水吸出，再用無菌水將洗凈后的臺(tái)蘑香蕈干子實(shí)體的菌褶組織配制成一組不同濃度的孢子懸液；

（3）孢子萌發(fā)和轉(zhuǎn)接：將步驟（2）配制的孢子懸液加至步驟（1）制作的抑菌用Be培養(yǎng)基中，在25±1℃下培養(yǎng)24 h，置于40倍物鏡下鏡檢挑選萌發(fā)的無色透明單核菌絲，將其轉(zhuǎn)移至新的Be抑菌培養(yǎng)基中；

(4) 培養(yǎng)雜合菌株：將長有5~6個(gè)萌發(fā)孢子的小菌落分散接種到具有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在25±1℃下培養(yǎng)5~6 d，挑取無拮抗作用的雜合菌絲觀察具有鎖狀聯(lián)合，基內(nèi)菌絲形態(tài)為致密整齊，無色素等沉積物，氣生菌絲的形態(tài)為純白色，密集匍匐，粗絨狀，初步確定為臺(tái)蘑香蕈純菌絲體；

（5）制備菌絲干品：將步驟（4）中的臺(tái)蘑香蕈純菌絲體液氮凍干備用；

（6）提取臺(tái)蘑香蕈DNA：將凍干的臺(tái)蘑香蕈純菌絲體中加入氧化鈷珠，在預(yù)冷至12~15℃的磨樣機(jī)中，以骨骼-肌肉模式磨樣500 s后，采用Omega試劑盒進(jìn)行DNA提取并將提取的臺(tái)蘑香蕈DNA在4℃冰箱保存；

(7) 臺(tái)蘑香蕈SCAR擴(kuò)增體系建立：將提取的臺(tái)蘑香蕈DNA用無菌水稀釋得到體積分?jǐn)?shù)為10%的模板DNA，采用臺(tái)蘑引物ITS8F是5′-AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT 3′，引物L(fēng)R3是3′-GGT CCG TGT TTC AAG GC-5′，擴(kuò)增體系是由10× PCR buffer 5 μL、含Mg²⁺的2.5m mol/L的 dNTP 4 μL、5U/ul Taq DNA Polymerase 0.8 μL、10 μmol/L檢測(cè)引物ITS8F和LR3各1 μL、模板DNA 2 μL、ddH₂O 36.2 μL組成的；在94℃預(yù)變性1 min后進(jìn)行SCAR-PCR反應(yīng)；SCAR-PCR反應(yīng)條件為94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；

（8）臺(tái)蘑香蕈SCAR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：擴(kuò)增結(jié)束后的SCAR-PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行DNA電泳檢測(cè)，電泳條件為100 v，1 h，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照擴(kuò)增得到的DNA特異條帶，測(cè)序并分析得到的分子量為1129 bp的片段為臺(tái)蘑香蕈菌種的標(biāo)志物。

2.如權(quán)利要求1所述的基于臺(tái)蘑香蕈子實(shí)體干品的菌種快速分離純化方法，其特征在于：步驟（1）中，1-正丁胺基甲酰-2-苯并咪唑-氨基甲酸甲酯和無菌水的質(zhì)量體積比為15mg/mL。

3.如權(quán)利要求1所述的基于臺(tái)蘑香蕈子實(shí)體干品的菌種快速分離純化方法，其特征在于：步驟（2）中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子懸液的濃度，其濃度范圍為182±13~1795±65個(gè)/mL。

4.如權(quán)利要求1所述的基于臺(tái)蘑香蕈子實(shí)體干品的菌種快速分離純化方法，其特征在于：步驟（6）中，磨樣機(jī)通過加液氮預(yù)冷至12~15℃，盛有5 mg凍干的臺(tái)蘑香蕈純菌絲體的2mL離心管中加入10~15個(gè)直徑為2 mm的氧化鈷珠進(jìn)行研磨。