[發明專利]一種干細胞外泌體補片及其制備方法

在審

• 申請號: 201910908543.6
• 申請日: 2019-09-25
• 公開（公告）號: CN112553138A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 丁小梅
• 申請（專利權）人: 深圳光彩生命工程技術有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0735;C12N5/074;C12N5/0775;C12N5/0789;C12N5/0797;C12N11/00
• 代理公司: 北京中仟知識產權代理事務所(普通合伙) 11825
• 代理人: 田江飛

1.一種干細胞外泌體補片，包括補片基材，其特征在于：所述補片基材的上部設有隔離層，所述隔離層的上部設有干細胞的外泌體，所述干細胞的外泌體為干細胞分泌的分子直徑為30-100nm的亞細胞雙層囊膜泡。

2.一種干細胞外泌體補片的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1：制備電紡液：將聚(左旋乳酸-己內酯)和聚氨酯加入有機溶劑中，其中聚(左旋乳酸-己內酯)、聚氨酯和有機溶劑的質量比為6:2:92，攪拌溶解1-3天，燒杯口用保鮮膜封閉，放置于恒溫多磁頭攪拌器攪拌溶解，攪拌速度200-2000rpm，攪拌1-3天后得到電紡液；

S2：液體紡絲：將步驟S1制取的電紡液在高壓靜電動態紡紗裝置中進行靜電紡絲，所述高壓靜電動態紡紗裝置包括：溶液儲存裝置、噴射裝置、水浴裝置和接收卷軸，靜電紡絲的溫度37-42℃，靜電紡絲電壓1-3kv，噴射裝置輸送溶液速度0.5-3ml/h，噴射裝置中所需針頭型號為8號，針頭與水浴裝置的距離為10-20cm，水浴裝置中水的深度為5-40cm，水浴裝置底部孔徑為0.1-1.5cm,水浴裝置與接收卷軸之間的距離5-20cm，即得到補片基材；

S3：噴涂隔離層：將步驟S3中制取的補片基材從接收卷軸上取下，在補片基材上側和下側噴涂隔離層，所述隔離層為聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯和乙烯聚四氟乙烯中的一種或幾種，即得到噴涂隔離層后的補片基材；

S4：補片基材后處理：將步驟S3中取得的補片基材，放置于-80℃冰箱2-12小時，取出后放入冷凍干燥機約24-48小時，溫度為-(20-80)℃，壓力為0.6-1.0MPa，冷凍干燥后的補片裁剪成長10cm、寬10cm；

S5：制取過濾外泌體：無菌條件下收集純化的干細胞的培養上清液10mL，在4℃下以300r/min離心10分鐘后，吸取上清液至另一干凈無菌的15mL離心管中，在4℃下以2000r/min離心20分鐘，吸取上清液至另一干凈無菌的15mL離心管中，在超凈工作臺中，將收集得到的液體用0.22μm濾膜過濾，收集濾后液體，在4℃下以1000r/min離心70分鐘，得到白色沉淀即為外泌體，吸去上清液，加無菌PBS磷酸緩沖液洗滌，在4℃下以1000r/min離心60分鐘，用1mL無菌PBS重懸外泌體，再用100nm超濾離心管于4℃下以300r/min離心30分鐘過濾，之后用0.22μm超濾離心管于4℃下以300r/min離心30分鐘過濾外泌體備用；

S6：補片基材消毒：將步驟S4中取得的補片基材用無菌生理鹽水擦洗10次，置于無菌方盤中，使用含抗生素的碳酸鹽緩沖液浸泡2次，每次5分鐘，將補片基材置入無菌純水中，在37℃水浴中浸泡30分鐘，浸泡后置入10mL含0.3％(w/v)十二烷基硫酸鈉的無菌PBS鹽溶液(0.01mol/L、pH＝6～8)中，在37℃水浴中震蕩處理，震蕩轉速為185rpm，震蕩10～12小時，后置入50ml含抗生素的碳酸鹽緩沖液中，在25℃水浴中震蕩沖洗6次，每次60分鐘，得到洗凈后的補片基材，用鈷60照射滅菌后，4℃下保存備用；

S7：制得干細胞外泌體補片：將步驟S6中消毒過的補片基材取出，并滴加步驟S5中制取的過濾外泌體，放入37℃培養箱中靜置5-10min使其凝固，即可獲得干細胞外泌體補片。

3.根據權利要求2所述的干細胞外泌體補片的制備方法，其特征在于：所述有機溶劑為六氟異丙醇溶劑。

4.根據權利要求2所述的干細胞外泌體補片的制備方法，其特征在于：所述干細胞為心臟干細胞、皮膚干細胞、血管內皮祖細胞、神經干細胞、造血干細胞、胚胎干細胞、誘導性多潛能分化細胞、間充質干細胞、脂肪干細胞、羊膜干細胞、角膜緣干細胞、成體干細胞和經血干細胞中的一種或幾種。

5.根據權利要求2所述的干細胞外泌體補片的制備方法，其特征在于：所述抗生素為100U/mL青霉素G和100μg/mL硫酸鏈霉素。

6.根據權利要求2所述的干細胞外泌體補片的制備方法，其特征在于：所述碳酸鹽緩沖液的濃度為0.05mol/L，pH為9.0～9.6。