[發明專利]一種改良的真菌原生質體的制備方法

在審

• 申請號: 201910893346.1
• 申請日: 2019-09-20
• 公開（公告）號: CN110616152A
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 黃龍花;史釧;劉遠超;莫偉鵬;梁曉薇;胡惠萍
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所(廣東省微生物分析檢測中心);廣東粵微食用菌技術有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 44001 廣州科粵專利商標代理有限公司
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了一種改良的真菌原生質體的制備方法。真菌菌絲經洗滌、酶解破壁、收集原生質體，然后進行再生培養，最后挑取目標單菌落，并進行是否單核體檢驗，獲得原生質體單核菌株；所述的真菌菌絲的制備方法為：在真菌固體培養基上覆蓋一層滅菌的膜得到帶膜培養基，在帶膜培養基上接種真菌，然后培養直至長出菌絲，取膜上菌絲，即獲得真菌菌絲。本發明的改良的真菌原生質體制備方法，其污染率低、原生質體的數量、再生率和單核率高，為真菌組學研究和雜交育種提供穩定高效的基礎技術支撐。

技術領域：

本發明屬于真菌原生質體制備領域，具體涉及一種改良的真菌原生質體的制備方法。

背景技術：

原生質體制備是真菌研究人員常用的技術方法，它可用于獲得單核體，為真菌組學研究和雜交育種等提供高質量的試驗材料，因此是極重要的基礎技術。目前文獻報道的真菌原生質體單核菌株制備方法，最常見的是先對菌株進行液體發酵；接著收集液體菌絲進行反復洗滌、酶解破壁(早期也有使用物理破壁)、收集原生質體；然后進行再生培養；最后挑取目標單菌落，并進行是否單核體檢驗。原生質體制備單核體的效果主要取決于四點：一是有無污染；二是原生質體數量；三是原生質體再生率；四是單核率。

但是筆者研究發現，現有技術中的真菌原生質體的制備方法中僅“污染率”就嚴重制約了原生質體單核菌株制備的成功率，即使沒污染，原生質體的數量、再生率和單核率都比較低。

發明內容：

本發明的目的是提供一種污染率低(甚至無污染)、原生質體的數量、再生率和單核率高的改良的真菌原生質體的制備方法。

本發明的改良的真菌原生質體的制備方法，包括以下步驟：真菌菌絲經洗滌、酶解破壁、收集原生質體，然后進行再生培養，最后挑取目標單菌落，并進行是否單核體檢驗，獲得原生質體單核菌株；

所述的真菌菌絲的制備方法為：在真菌固體培養基上覆蓋一層滅菌的膜得到帶膜培養基，在帶膜培養基上接種真菌，然后培養直至長出菌絲，取膜上菌絲，即獲得真菌菌絲。

優選，所述的膜是賽璐玢膜。

優選，所述的真菌是靈芝(Ganoderma lingzhi)。

優選，所述的真菌菌絲的制備方法為：在真菌固體培養基上覆蓋一層滅菌的賽璐玢膜得到帶膜培養基，在帶膜培養基上接種靈芝(Ganoderma lingzhi)的種塊，蓋好平板，并用封口膜封住，25℃暗培養5-10天，真菌長出菌絲，在超凈臺內用無菌鑷子挑起賽璐玢膜，取菌絲體置于離心管中，獲取菌絲，所述的真菌固體培養基是加富綜合PDA培養基，每升配制方法為：先馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，過濾取濾汁，再與瓊脂20g，葡萄糖20g，KH₂PO₄3g，MgSO₄1.5g，蛋白胨10g，維生素B₁0.2-0.5g混合，加水至總體積為1000ml，混合均勻，滅菌即得。

所述的經洗滌、酶解破壁、收集原生質體，然后進行再生培養，最后挑取目標單菌落，并進行是否單核體檢驗，獲得原生質體單核菌株，具體步驟為：

A、稱取記錄真菌菌絲重量，用穩滲液洗滌，離心棄上清取菌絲；

B、按照“每300mg菌絲加1ml酶液”的量加入質量分數為2％的溶壁酶，30℃水浴酶解2.5小時；

C、用G3砂芯漏斗超真空抽濾濾去菌絲，抽濾瓶收集原生質體，用穩滲液再次洗滌抽濾菌絲后，將原生質體從抽濾瓶轉移至離心管，穩滲液洗滌離心棄上層，用穩滲液重懸獲得原生質體懸液；

D、將原生質體懸液接種至液體再生培養基中培養生長，生長后取長好的原生質體培養液涂布到固體再生培養基上生長，挑取單菌落，再接種到固體再生培養基，待單菌落菌絲長滿平板，對其進行是否單核體檢驗，獲得目標單核菌株。