[發明專利]一種環狀RNA快速鑒定方法

在審

• 申請號: 201910888999.0
• 申請日: 2019-09-19
• 公開（公告）號: CN110628884A
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 李玉紅;馬小艮;楊勁
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 50219 重慶百潤洪知識產權代理有限公司
• 代理人: 郝艷平

本發明涉及生物醫藥領域，具有涉及一種環狀RNA快速鑒定方法。本發明目的是在于提供一種使用便捷、可靠性高、經濟實惠的環狀RNA快速鑒定方法，該方法包括以下步驟：提取總RNA并采用隨機引物法合成cDNA；設計并合成三對引物，所述引物包括：針對成環區反向設計的環狀RNA引物、針對線性區對向設計線性RNA引物以及針對成環區對向設計的綜合RNA引物，利用所述引物進行PCR反應，結合PCR結果進行定量分析可判斷該位點是否形成了環狀RNA；本發明方法適用于用于鑒定臨床疾病環狀RNA標志物，也可用于開發試劑盒開展環狀RNA的科學研究，相對于現有技術而言，本發明方法可以實現環狀RNA的快速鑒定，降低成本的同時減少操作步驟。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種環狀RNA快速鑒定方法。

背景技術

環狀RNA(circRNA)是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環形結構的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于多種生物細胞中,具有結構穩定、序列保守及細胞或組織特異性表達等特征。目前研究表明,circRNA可通過多種途徑發揮作用，例如充當miRNA海綿與miRNA相作用、參與調節基因的轉錄、細胞周期或衰老等生理過程,還與人類健康殺手如癌癥和心臟病等多種疾病的調控過程密切相關,具有重要的研究價值和應用價值。

現有技術中對于環狀RNA的鑒定，一般分為初篩和確認兩個階段，在初篩階段，目前通用方法是設計反向引物鑒定環狀RNA，并設計對向引物鑒定對應的mRNA，然后通過RNA消化酶Rnase R消化，再次利用反向引物和對向引物鑒定，綜合兩次結果進行判斷。初篩認為確實存在環狀RNA的，再通過PCR產物測序或RNA探針進行確認。現行初篩方案需要兩輪鑒定，而且中間需要進行Rnase R消化操作。一方面，操作耗時；另一方面，Rnase R價格昂貴，導致該方法成本高昂。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明提供了一種環狀RNA快速鑒定方法，第一方面，無需使用Rnase R等昂貴試劑，能夠顯著降低實驗成本，另一方面，相對于常用技術手段，本發明避免了RNA酶消化步驟，不需要再進行第二次逆轉錄PCR實驗，便于簡化實驗操作，除此之外，對結果進行綜合分析初篩后，通過測序等手段可進一步確認新的環狀RNA分子，有助于發現新的環狀RNA。

為達到上述目的，本發明提供的一種環狀RNA快速鑒定方法，包括以下步驟：(1)提取總RNA，所述總RNA包括環狀RNA和線性

mRNA；

(2)采用隨機引物法合成cDNA。

(3)預測成環位點，針對所述成環位點設計并合成三對不同引物；

(4)分別采用三對不同引物對所述cDNA進行PCR擴增，區別于現有技術中需要通過RNase R處理消化線性mRNA、二次檢測環狀RNA的步驟，降低實驗成本且減少操作步驟；

(5)對PCR擴增結果進行定量分析并判斷是否形成環狀RNA，RNA的相對含量為其相對內參分子的含量，其中，若環狀RNA相對含量與線性RNA相對含量兩者之和小于總RNA相對含量，說明該成環位點，不止形成擬鑒定的環狀RNA，還有其他環狀RNA，可通過對環狀RNA引物的PCR產物進行分離，并通過測序進一步鑒定其他環狀RNA；若環狀RNA相對含量與線性RNA相對含量兩者之和等于總RNA相對含量，則說明該成環位點形成了擬鑒定的環狀RNA，并且所設計引物特異性非常好；若環狀RNA相對含量與線性RNA相對含量兩者之和大于總RNA相對含量，則說明該RNA分子，除了形成擬鑒定的環狀RNA分子外，還形成了其他成環位點不在設計位點的環狀RNA分子，且另外形成的環狀RNA分子的成環區包含線性RNA引物設計區域，需要進一步驗證。

進一步地，步驟(3)中所述引物包括：

環狀RNA引物，針對成環區反向設計，用于擴增環狀RNA；