[發(fā)明專(zhuān)利]PD-1人源化單鏈抗體融合基因轉(zhuǎn)化乳酸菌及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910873992.1
• 申請(qǐng)日: 2019-09-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110747154A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾位森;徐雪艷;范宏英;白楊;孟曉靜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州維生君生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/13;C12N15/62;A61K39/395;A61K47/64;A61P35/00;A61P31/12;A61P31/04;A61P37/04
• 代理公司: 44104 廣州知友專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 宣國(guó)華;劉艷麗

本發(fā)明公開(kāi)了PD?1人源化單鏈抗體融合基因轉(zhuǎn)化乳酸菌，包括PD1Fv基因或CTB?PD1Fv融合基因轉(zhuǎn)化乳酸菌，是將所述PD1Fv基因或CTB?PD1Fv融合基因插入到乳酸菌表達(dá)載體pLN并轉(zhuǎn)化乳酸菌獲得。還公開(kāi)了該轉(zhuǎn)化菌在制備具有腫瘤免疫治療效果的口服活菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中PD1Fv基因或CTB?PD1Fv融合基因轉(zhuǎn)化乳酸菌可制備成活菌懸液、乳制品、活菌菌粉、菌片或膠囊等活菌制劑，作為免疫治療活菌藥物口服后能在人體腸道內(nèi)增殖和定植，應(yīng)用于腫瘤、病毒感染或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染、原發(fā)性和繼發(fā)性免疫低下等疾病的預(yù)防與治療。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及PD-1人源化單鏈抗體融合基因轉(zhuǎn)化乳酸菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來(lái)，以免疫檢查點(diǎn)(checkpoint)分子為靶點(diǎn)的免疫治療是目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)，多種免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物，如PD-1、PD-L1人源化抗體已經(jīng)獲準(zhǔn)在臨床應(yīng)用，并獲得了較好的療效。

惡性腫瘤之所以能逃避免疫監(jiān)視，主要原因是惡性腫瘤細(xì)胞自身和免疫細(xì)胞都會(huì)表達(dá)一些免疫共抑制分子(co-inhibitory molecular)，又稱(chēng)為免疫檢查點(diǎn)(checkpoint)分子，產(chǎn)生免疫抑制，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。這也是腫瘤治療需要突破的主要障礙。T細(xì)胞活化后會(huì)表達(dá)一系列免疫檢查點(diǎn)分子，如細(xì)胞毒T細(xì)胞抗原4(CTLA-4)、受體程序性死亡因子1(programmed death 1，PD-1)、T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(T cell immunoglobulin-3,TIM3)、淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG-3，CD223)、T細(xì)胞含ITIM結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain protein，TIGIT)等等。這些通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)控制免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，防止過(guò)度免疫應(yīng)答導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病。

惡性腫瘤細(xì)胞自身，以及抗原遞呈細(xì)胞(APC)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，抑制性免疫細(xì)胞等也表達(dá)一些免疫共抑制分子，參與免疫負(fù)調(diào)控。B7-H1(CD274)和B7-DC(CD273)是兩個(gè)重要的免疫抑制分子，二者都是CD80(B7.1)的同源分子，都能與T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合，抑制產(chǎn)生抗腫瘤免疫，抑制效應(yīng)T細(xì)胞(Te)對(duì)腫瘤的殺傷作用。因而，二者又分別被稱(chēng)為PD-1配體1(PD-L1)和配體2(PD-L2)。PD-L1廣泛表達(dá)于各種惡性腫瘤細(xì)胞，受干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細(xì)胞因子的上調(diào)。PD-L2則主要表達(dá)于DC、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。PD-1主要在活化成熟的T細(xì)胞上有表達(dá)。未被激活的T細(xì)胞幾乎沒(méi)有PD-1的表達(dá)，只有T細(xì)胞活化后，才有PD-1表達(dá)。此外，在胸腺的雙陰性(CD4^-CD8^-)T細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和未成熟的朗格漢斯細(xì)胞，PD-1低表達(dá)。PD-1屬于CD28家族成員，與毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)有20％的同源性。PD-1是由268個(gè)氨基酸組成的I型跨膜糖蛋白，它的結(jié)構(gòu)主要包括胞外免疫球蛋白可變區(qū)(IgV)樣結(jié)構(gòu)、疏水的跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)。胞內(nèi)區(qū)尾部有2個(gè)獨(dú)立的酪氨酸殘基，氮端的酪氨酸殘基參與構(gòu)成一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM)，碳端酪氨酸殘基則參與構(gòu)成一個(gè)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif，ITSM)。PD-1與PD-L1在激活的T細(xì)胞結(jié)合后，促使PD-1的ITSM結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸發(fā)生磷酸化，進(jìn)而引起下游蛋白激酶Syk和PI3K的去磷酸化，抑制下游AKT、ERK等通路的活化，最終抑制T細(xì)胞活化所需基因及細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞活性的作用。PD-L1和PD-L2都能與T細(xì)胞上的受體PD-1或者CD80結(jié)合。一方面抑制T細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡；另一方面抑制Te細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用。