[發明專利]一種鈣營養需求相關基因突變位點的檢測方法

在審

• 申請號: 201910860892.5
• 申請日: 2019-09-11
• 公開（公告）號: CN110484609A
• 公開（公告）日: 2019-11-22
• 發明（設計）人: 張立波;張宇
• 申請（專利權）人: 杭州云鼎基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 51224 成都頂峰專利事務所(普通合伙)
• 代理人: 王霞<國際申請>=<國際公布>=<進入國

1.一種鈣營養需求相關基因突變位點的檢測方法，其特征在于，通過設計的目標位點特異性引物的單管多重PCR擴增反應得到目標片段，目標片段經過限制性內切酶消化，然后再利用單堿基延伸技術對經過限制性內切酶消化的目標片段進行雙向延伸，得到待檢基因位點，最后通過核酸質譜分析精確測定目標DNA序列；

其中，所述單堿基延伸技術是采用單堿基延伸引物組對所述目標片段進行雙向延伸。

2.根據權利要求1所述的鈣營養需求相關基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述目標位點特異性引物包括：

用于擴增鈣營養需求相關基因VDR-RS1544410片段的第一特異性引物，第一特異性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：1所示且反向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：2所示；

用于擴增鈣營養需求相關基因CASR-RS1042636片段的第二特異性引物，第二特異性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：3所示且反向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：4所示。

3.根據權利要求1所述的鈣營養需求相關基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述單堿基延伸技術所用的單堿基延伸引物組包括：

用于擴增鈣營養需求相關基因VDR-RS1544410片段的第一單堿基延伸引物，核苷酸序列如SEQ ID Nos：5所示；

用于擴增鈣營養需求相關基因CASR-RS1042636片段的第二單堿基延伸引物，核苷酸序列如SEQ ID Nos：6所示。

4.根據權利要求3所述的鈣營養需求相關基因突變位點的檢測方法，其特征在于，在第一單堿基延伸引物的5`端和第二單堿基延伸引物的5`端均加入10個核苷酸，10個核苷酸的固定序列為ACGTTGGATG。

5.根據權利要求1或4所述的鈣營養需求相關基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述單管多重PCR擴增的反應程序為：95℃2分鐘，95℃30秒，56℃20秒，72℃60秒，45循環，72℃5分鐘，4℃保溫。

6.根據權利要求1所述的鈣營養需求相關基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述限制性內切酶為蝦堿性磷酸酶。

7.根據權利要求1或6所述的鈣營養需求相關基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述限制性內切酶消化處理的程序為：37℃消化處理45分鐘，85℃加熱變性5分鐘，冰浴10分鐘。

8.根據權利要求1所述的鈣營養需求相關基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述雙向延伸的程序為：94℃30秒；94℃5秒，52℃5秒，80℃，5秒，5個循環，40個循環；72℃3分鐘，4℃保溫。

9.根據權利要求1或8所述的鈣營養需求相關基因突變位點的檢測方法，其特征在于，所述核酸質譜分析的具體步驟為：

S1：在樹脂板上鋪好待用樹脂，風干3-8分鐘；

S2：向樣本板的反應孔中加入待測的樣本，補充41μL ddH₂O，用封口膜密封，3000rpm/min，瞬時離心；

S3：除去封口膜，將樣本板倒扣在步驟S1中的樹脂板上固定，然后將樣本板和樹脂板一起翻轉，使風干的樹脂落入樣本板的反應孔內，用封口膜密封，3000rpm/min，瞬時離心；

S4：將步驟S3中的樣本板置于旋轉器上在800rpm/min的轉速下旋轉30分鐘，在3000rpm/min，離心5分鐘，然后點樣上機，用核酸質譜儀進行檢測。