[發(fā)明專利]利用PCR-RFLP檢測綿羊DAZL基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910860404.0
• 申請日: 2019-09-11
• 公開（公告）號: CN110592190B
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發(fā)明（設計）人: 樂祥鵬;羅靜;秦芳;李發(fā)弟;李萬宏
• 申請（專利權）人: 甘肅潤牧生物工程有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/683
• 分類號: C12Q1/683;G16B5/00
• 代理公司: 成都時譽知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 51250
• 代理人: 何悅

1.利用PCR-RFLP檢測湖羊DAZL基因單核苷酸多態(tài)性的方法在湖羊分子育種中的應用，其特征在于，所述方法包括利用PCR-RFLP檢測湖羊DAZL基因第26750位為G或A的單核苷酸多態(tài)性；所述應用為建立基因型為GG純合型的湖羊群體，提高湖羊產(chǎn)羔率。

2.根據(jù)權利要求1所述的利用PCR-RFLP檢測湖羊DAZL基因單核苷酸多態(tài)性的方法在湖羊分子育種中的應用，其特征在于，

所述的檢測方法包括以下步驟：

S1采集屠宰湖羊的睪丸組織，經(jīng)過液氮環(huán)境保存后，再經(jīng)過研磨成粉，將得到的粉末取0.1g置于1000 μL DNA抽提緩沖液，并經(jīng)過在55℃下的蛋白酶K處理，取反應后溶液經(jīng)過Tris-飽和酚處理得到DNA提取液；

S2將所述的DNA提取液經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇電泳結(jié)果中條帶均一、無拖尾和無降解的DNA提取液，稀釋至50 ng/μL；

S3采用混合加樣法以特異性引物對P進行PCR擴增，得到多個DNA樣品片段，將所述的多個DNA樣品片段采用限制性內(nèi)切酶AluI消化后，進行瓊脂糖凝膠電泳，將得到的多個DNA樣品小分子進行切膠回收及純化，得到純化DNA；所述的特異性引物對P為：

上游引物：5’- AGTTTGGAGTCTCAGGATTT -3’ 20nt，

下游引物：5’- GCATGATGTACTCTGTGTAG -3’ 20nt；

S4針對所述純化DNA進行凝膠成像，判定其基因型，確定純化DNA的基因型；將所述純化DNA進行雙向測序，判定綿羊DAZL基因第26750位的單核苷酸多態(tài)性。

3.根據(jù)權利要求2所述的利用PCR-RFLP檢測湖羊DAZL基因單核苷酸多態(tài)性的方法在湖羊分子育種中的應用，其特征在于，

所述S2中稀釋步驟前將選取的DNA提取液通過吸光度檢測判定是否需要純化處理。

4.根據(jù)權利要求3所述的利用PCR-RFLP檢測湖羊DAZL基因單核苷酸多態(tài)性的方法在湖羊分子育種中的應用，其特征在于：所述的通過吸光度檢測判定為：測定DNA提取液在260nm、280nm的紫外光下的OD值，計算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值；當OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值小于1.6時，進行純化處理；當OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值大于1.8時，進行去除RNA的純化。

5.根據(jù)權利要求2所述的利用PCR-RFLP檢測湖羊DAZL基因單核苷酸多態(tài)性的方法在湖羊分子育種中的應用，其特征在于：計算DNA含量公式為：

DNA濃度ng/μL=50×OD₂₆₀值×稀釋倍數(shù)。

6.根據(jù)權利要求2所述利用PCR-RFLP檢測湖羊DAZL基因單核苷酸多態(tài)性的方法在湖羊分子育種中的應用，其特征在于：所述的PCR擴增為：94℃預變性5min；94℃變性30 s，57℃退火30s，72℃延伸30s，34個循環(huán)；72℃延伸5 min。

7.根據(jù)權利要求2所述的利用PCR-RFLP檢測湖羊DAZL基因單核苷酸多態(tài)性的方法在湖羊分子育種中的應用，其特征在于：所述的混合加樣法為：根據(jù)每一個PCR反應體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應所需的所述PCR反應體系的個數(shù)，算出各種反應組分的總量，加入到1個1.5 mL或者2.0 mL離心管中，充分混勻后瞬時離心，再分裝到每個0.2 mLEppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時離心后進行PCR擴增。

8.根據(jù)權利要求7所述的利用PCR-RFLP檢測湖羊DAZL基因單核苷酸多態(tài)性的方法在湖羊分子育種中的應用，其特征在于：所述的PCR反應體系為：2.5μL的1×buffer緩沖液、0.5μL的10pmol/L的特異性引物對P、5.0μL的濃度為50ng/μL的品種DNA池和17.0μL的滅菌超純水。