[發明專利]一種誘導干細胞定向軟骨分化的方法有效
| 申請號： | 201910859880.0 | 申請日： | 2019-09-11 |
| 公開（公告）號： | CN110684725B | 公開（公告）日： | 2021-06-29 |
| 發明（設計）人： | 姚詠嫦;張廷帥;陳漢政;陳藝;張姝江 | 申請（專利權）人： | 廣州醫科大學附屬第一醫院（廣州呼吸中心） |
| 主分類號： | C12N5/077 | 分類號： | C12N5/077;C12N5/10;C12N11/10;C12N11/04 |
| 代理公司： | 廣州正明知識產權代理事務所(普通合伙) 44572 | 代理人： | 成姍 |
| 地址： | 510000 *** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 誘導 干細胞 定向 軟骨 分化 方法 | ||
1.一種誘導干細胞定向軟骨分化的方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1、構建攜帶轉化生長因子TGF-β3的腺病毒載體，擴增至109 IFU/mL后凍存備用；
S2、軟骨細胞的分離和培養：軟骨細胞分離自豬股骨髁軟骨，待細胞長至融合度為70-80%時進行細胞傳代，以1：3傳代，傳至3代后凍存備用；
S3、將ATDC5細胞傳至3代后凍存備用；
S4、將步驟S1中攜帶TGF-β3的腺病毒轉染到步驟S2中的軟骨細胞中；
S5、共培養：將ATDC5細胞和步驟S4中轉染后的軟骨細胞進行混合，加入海藻酸鈉溶液，配置成一定細胞密度的細胞懸液，將該細胞懸液快速打入CaCl2溶液中使其生成細胞凝膠，然后將細胞凝膠置于軟骨誘導液中進行培養，直至完成定向軟骨分化過程1。
2.根據權利要求1所述的一種誘導干細胞定向軟骨分化的方法，其特征在于，所述豬股骨髁軟骨為4到8個月大的豬股骨髁軟骨。
3.根據權利要求1所述的一種誘導干細胞定向軟骨分化的方法，其特征在于，步驟S3中所述的ATDC5細胞采用F12培養基進行傳代培養。
4.根據權利要求1所述的一種誘導干細胞定向軟骨分化的方法，其特征在于，步驟S4中攜帶TGF-β3的腺病毒的MOI為100。
5.根據權利要求1所述的一種誘導干細胞定向軟骨分化的方法，其特征在于，所述ATDC5細胞和轉染后的軟骨細胞以3:1的比例進行混合。
6.根據權利要求1所述的一種誘導干細胞定向軟骨分化的方法，其特征在于，所述細胞懸液的細胞密度為6×106個/mL。
7.根據權利要求1所述的一種誘導干細胞定向軟骨分化的方法，其特征在于，所述海藻酸鈉溶液的質量分數為1.0~1.5%，所述CaCl2溶液的摩爾濃度為100~110 mM。
8.根據權利要求1所述的一種誘導干細胞定向軟骨分化的方法，其特征在于，所述細胞凝膠在培養過程中，每三天更換一次軟骨誘導液培養。
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