[發明專利]木聚糖酶、編碼它們的核酸以及其制備和應用方法

在審

• 申請號: 201910859233.X
• 申請日: 2008-08-01
• 公開（公告）號: CN110577945A
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發明（設計）人: K·A·加里;R·德爾梅爾
• 申請（專利權）人: 維萊尼姆公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12P19/14;C12P19/02
• 代理公司: 11245 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 丁秀云

1.分離的、合成的或重組的核酸(多核苷酸)，其包含

(a)編碼至少一種多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包含與下列核酸序列具有至少約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或完全(100％)序列同一性的序列：

(ⅰ)SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列，其具有表1中所述的一個或更多個核苷酸殘基改變(或其等價物)，或具有下列核苷酸殘基改變中的至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或18個或一些或全部：編碼氨基酸殘基4的密碼子由ACC變為AAC；編碼氨基酸殘基4的密碼子由ACC變為CGC；編碼氨基酸殘基4的密碼子由ACC變為CAC；編碼氨基酸殘基9的密碼子由CCC變為GAC；編碼氨基酸殘基17的密碼子由TTC變為GTC；編碼氨基酸殘基21的密碼子由TTC變為TAC；編碼氨基酸殘基33的密碼子由CTG變為GCG；編碼氨基酸殘基38的密碼子由CGT變為CAC；編碼氨基酸殘基44的密碼子由AGC變為ACG；編碼氨基酸殘基63的密碼子由ATC變為GTC；編碼氨基酸殘基73的密碼子由GGC變為TAC；編碼氨基酸殘基73的密碼子由GGC變為GAG；編碼氨基酸殘基73的密碼子由GGC變為GTC；編碼氨基酸殘基108的密碼子由TTC變為AAG；編碼氨基酸殘基125的密碼子由CAG變為TAC；編碼氨基酸殘基150的密碼子由GTA變為GCC；編碼氨基酸殘基188的密碼子由AGC變為GAG和/或編碼氨基酸殘基189的密碼子由TCC變為CAG；或

(ⅱ)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQID NO:23的核酸(多核苷酸)序列；

其中(i)或(ii)的所述核酸編碼具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一種多肽，或編碼能夠產生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特異性抗體(起表位或免疫原作用的多肽或肽)的多肽或肽，

(b)(a)的核酸(多核苷酸)，其中所述序列同一性如下測定：(A)通過用序列比對算法分析或通過視覺觀察，或(B)在至少約20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多個殘基的區域上，或在cDNA、轉錄物(mRNA)或基因的全長上；

(c)(a)或(b)的核酸(多核苷酸)，其中所述序列比對算法是2.2.2版BLAST算法，其中過濾設置被設置為blastall-p blastp-dnr pataa-F F并且所有其它選項被設置為默認值；

(d)編碼至少一種多肽或肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包含在嚴格條件下與這樣的核酸雜交的序列：所述核酸包含SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列以及具有表1中所述的一個或更多個核苷酸殘基改變(或其等價物)，或具有下列核苷酸殘基改變中的至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或18個或一些或全部改變：編碼氨基酸殘基4的密碼子由ACC變為AAC；編碼氨基酸殘基4的密碼子由ACC變為CGC；編碼氨基酸殘基4的密碼子由ACC變為CAC；編碼氨基酸殘基9的密碼子由CCC變為GAC；編碼氨基酸殘基17的密碼子由TTC變為GTC；編碼氨基酸殘基21的密碼子由TTC變為TAC；編碼氨基酸殘基33的密碼子由CTG變為GCG；編碼氨基酸殘基38的密碼子由CGT變為CAC；編碼氨基酸殘基44的密碼子由AGC變為ACG；編碼氨基酸殘基63的密碼子由ATC變為GTC；編碼氨基酸殘基73的密碼子由GGC變為TAC；編碼氨基酸殘基73的密碼子由GGC變為GAG；編碼氨基酸殘基73的密碼子由GGC變為GTC；編碼氨基酸殘基108的密碼子由TTC變為AAG；編碼氨基酸殘基125的密碼子由CAG變為TAC；編碼氨基酸殘基150的密碼子由GTA變為GCC；編碼氨基酸殘基188的密碼子由AGC變為GAG；和/或編碼氨基酸殘基189的密碼子由TCC變為CAG，

其中所述多肽或肽具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性或能夠產生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特異性抗體(起表位或免疫原作用的多肽或肽)，

以及所述嚴格條件包括這樣的洗滌步驟，其包含在約65℃溫度下于0.2×SSC中洗滌約15分鐘；

(e)編碼至少一種多肽或肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包含在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23序列的核酸雜交的序列，

以及所述嚴格條件包括這樣的洗滌步驟，其包含在約65℃溫度下于0.2×SSC中洗滌約15分鐘；

(f)(a)至(d)中任意的核酸(多核苷酸)，其長度為至少約20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多個核苷酸殘基，或基因或轉錄物的全長；

(g)編碼具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一種多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2的序列或其酶促活性片段，以及具有表1中所述的至少一個氨基酸殘基改變(或其等價物)，或具有下列氨基酸殘基改變中的至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或18個或一些或全部改變：氨基酸殘基4從T(或thr或蘇氨酸)變為N(或asn或天冬酰胺)；氨基酸殘基4從T(或thr或蘇氨酸)變為R(或arg或精氨酸)；氨基酸殘基4從T(或thr或蘇氨酸)變為H(或his或組氨酸)；氨基酸殘基9從P(或pro或脯氨酸)變為D(或asp或天冬氨酸))；氨基酸殘基17從F(或phe或苯丙氨酸))變為V(或val或纈氨酸)；氨基酸殘基21從F(或phe或苯丙氨酸))變為Y(或tyr或酪氨酸)；氨基酸殘基33從L(或leu或亮氨酸)變為A(或ala或丙氨酸))；氨基酸殘基38從R(或arg或精氨酸)變為H(或his或組氨酸)；氨基酸殘基44從S(或ser或絲氨酸)變為T(或thr或蘇氨酸)；氨基酸殘基63從I(或ile或異亮氨酸))變為V(或val或纈氨酸)；氨基酸殘基73從G(或gly或甘氨酸)變為Y(或tyr或酪氨酸)；氨基酸殘基73從G(或gly或甘氨酸)變為V(或val或纈氨酸)；氨基酸殘基73從G(或gly或甘氨酸)變為E(或glu或谷氨酸)；氨基酸殘基108從F(或phe或苯丙氨酸)變為K(或lys或賴氨酸)；氨基酸殘基125從Q(或gln或谷氨酰胺)變為Y(或tyr或酪氨酸)；氨基酸殘基150從V(或val或纈氨酸)變為A(或ala或丙氨酸))；氨基酸殘基188從S(或ser或絲氨酸)變為E(或glu或谷氨酸)；和/或氨基酸殘基189從S(或ser或絲氨酸)變為Q(或gln或谷氨酰胺)；

(h)編碼具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一種多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24的序列或其酶促活性片段；

(i)(A)(a)至(h)中任意的核酸(多核苷酸)并且編碼這樣的多肽，所述多肽具有至少一個保守氨基酸替代并且保持其木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性；或(B)(i)(A)的核酸，其中至少一個保守氨基酸替代包括用相似特性的另一種氨基酸替代氨基酸；或保守替代包括：用另一種脂肪族氨基酸置換脂肪族氨基酸；用蘇氨酸置換絲氨酸或反之亦然；用另一種酸性殘基置換酸性殘基；用帶有酰胺基團的另一種殘基置換帶有酰胺基團的殘基；用另一種堿性殘基交換堿性殘基；或用另一種芳香族殘基置換芳香族殘基；

(j)(a)至(i)的任意核酸(多核苷酸)，其編碼具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽，但缺少信號序列、前原結構域、錨定結構域和/或糖結合模塊(CBM)；

(k)(j)的核酸(多核苷酸)，其中所述糖結合模塊(CBM)包含木聚糖結合模塊、纖維素結合模塊、木質素結合模塊、木糖結合模塊、甘露聚糖酶結合模塊、木糖葡聚糖特異性模塊和/或阿拉伯呋喃糖苷酶結合模塊或由其組成；

(l)(a)至(k)的任意核酸(多核苷酸)，其編碼具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽，進一步包含異源序列；

(m)(l)的核酸(多核苷酸)，其中所述異源序列包含編碼下列的序列或由其組成：(A)異源信號序列、異源糖結合模塊、異源錨定結構域、異源催化結構域(CD)或其組合；(B)(l)的序列，其中所述異源信號序列、糖結合模塊或催化結構域(CD)源自異源酶；或(C)標記、表位、靶向肽、可切割序列、可檢測部分或酶；

(n)(l)的核酸(多核苷酸)，其中所述異源糖結合模塊(CBM)包含木聚糖結合模塊、纖維素結合模塊、木質素結合模塊、木糖結合模塊、甘露聚糖酶結合模塊、木糖葡聚糖特異性模塊和/或阿拉伯呋喃糖苷酶結合模塊或由其組成；

(o)(l)的核酸(多核苷酸)，其中所述異源信號序列將編碼的蛋白靶向液泡、內質網、葉綠體或淀粉顆粒；或

(p)與(a)至(o)的任意序列充分(完全)互補的核酸序列(多核苷酸)。