[發明專利]一種去除核糖體RNA的反轉錄引物池、試劑盒及去除核糖體RNA的方法

在審

• 申請號: 201910856846.8
• 申請日: 2019-09-11
• 公開（公告）號: CN111534512A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 曹亮;吳勝標;喻志紅;蔣華;束文圣
• 申請（專利權）人: 廣東美格基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種去除核糖體RNA的反轉錄引物池、試劑盒及去除核糖體RNA的方法；該反轉錄引物池的序列如SEQ ID NO：1～10所示；該試劑盒包含上述反轉錄引物池，本發明利用原核生物共有的rRNA序列，設計不同密度覆蓋的反轉錄引物，根據具體需要去除的RNA中本身的rRNA序列的差異，進行特異性的反轉錄，從而得到與目標RNA完全反向互補的cDNA序列，再通過后續的RNase H和DNase I特異性消化雜合鏈的rRNA和cDNA，最終去除核糖體RNA；該方法能夠搭配建庫試劑盒，最終得到濃度足夠高的轉錄組文庫，從而有效實現轉錄組測序在基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域的廣泛應用。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種去除核糖體RNA構建轉 錄組測序文庫的反轉錄引物池、試劑盒，以及去除核糖體RNA的方法。

背景技術

隨著現代科學技術的發展，生命科學的研究已經進入了組學時代。基因 和基因組測序技術已經成為現代生命科學研究，特別是基因組學研究中不可 或缺的手段。近年來新一代基因組測序技術突飛猛進的發展帶來了基因組學 研究的空前繁榮。新一代測序技術已經在生命科學各個領域及農學、醫學、 環境保護、法醫等領域中得到廣泛的應用。隨著新一代高通量測序技術的快 速發展，轉錄組測序已經成為研究轉錄組與基因表達的重要手段。轉錄組是 指單個生物物種的個體，或者該個體的特定組織或特定原核生物類型，在特定的環境條件下，或者實驗處理條件下所產生的所有轉錄本的集合。各種類 型的轉錄本都可以通過新一代測序技術進行高通量定量檢測，這項技術被稱 為轉錄組測序。轉錄組測序技術可以用作轉錄本的結構及其變異、基因表達 水平、非編碼區域功能和低豐度全新轉錄本發現等各方面的研究上。通過對 轉錄組的研究，人們能夠從生物的整體水平上研究基因結構及其基因功能。 轉錄組測序已被廣泛應用于遺傳學、農學和醫學基礎研究、醫療診斷和藥物 研發等領域中。

核糖體RNA(rRNA)構成原核生物RNA含量的絕大部分，其占原核 生物內RNA含量的約80％-95％。高豐度的rRNA使樣本中其他相關的目標 分子的分析復雜化，如轉錄組測序(RNA-seq)分析、微陣列的基因表達分 析等；尤其在目標分子含量較少的研究中，rRNA成為巨大的背景污染。因此， 通常在構建RNA文庫(例如構建轉錄組文庫時)，需要對總RNA進行mRNA (比例約為10％)純化處理。

轉錄組測序能全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在特定狀態下的 幾乎所有轉錄本序列信息，是研究基因表達調控的主要手段。轉錄組測序中 樣品是來源于原核生物和組織中經分離的總RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA、 LncRNA和小RNA等。對于轉錄組分析中的目標RNA(mRNA和LncRNA)，rRNA的數據屬于冗余信息，在轉錄組測序中的RNA文庫構建中，首先會進 行rRNA的去除，再進行常規的RNA建庫。

現有的用于去除rRNA，進行轉錄組文庫構建的試劑盒，主流的試劑盒使 用RNA探針結合鏈霉親和素磁珠方法去除rRNA，如Illumina的 Stranded Total RNA LT-(with Ribo-Zero TM Bacteria)，其試劑盒的探針為外 源性合成，價格昂貴，而且只能基于1-2個物種進行設計，其他種屬的物種 甚至亞種未能保證其去除效率，而且總RNA起始量為100ng-1ug，對于總RNA 起始量為1ng-100ng的樣品，暫未有能有效去除其rRNA、進行轉錄組文庫構 建的試劑盒。這一限制可能導致試劑盒標注物種以外的其他原核物種，或者 血漿、血清和Exosome等樣品來源的轉錄組測序文庫構建中存在嚴重的rRNA 殘留、數據冗余，從而影響后續的mRNA或LncRNA的檢出與分析。最后， 由于本發明使用的方法是特異性的反轉錄引物結合后，特異性的擴增對應物 種的rRNA，并且利用雙酶進行酶解消除，因此不受物種間rRNA序列局部差 異的影響，原理上能應用于原核源性的其他物種的核糖體去除，實現了不同 物種來源的RNA都使用同一套引物進行實驗的目的。

發明內容