[發明專利]酶活提高的麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體

有效

• 申請號: 201910853825.0
• 申請日: 2017-09-13
• 公開（公告）號: CN110592060B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;姚鍇琳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12P19/24;C12P19/12
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了酶活提高的麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術領域。本發明提供了一系列酶活提高的麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體。突變體G586D、F284V/G586D、F284V/T439A/G586D麥芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活分別為野生酶的1.4倍、2.4倍、3.4倍。

本申請是原申請號為201710822065.8、申請日為2017年9月13日，發明名稱為一種麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體及其應用的分案申請。

技術領域

本發明涉及酶活提高的麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術領域。

背景技術

海藻糖(Trehalose)由兩個吡喃葡萄糖分子通過α,α-1,1-糖苷鍵連接而成，是一種穩定的非還原性寡糖，同時具有高度安全性和有良好的穩定性，被廣泛應用于醫藥、食品、化妝和農業等領域。自1995年以來，日本、美國和歐盟等先后批準海藻糖可以用作食品添加劑。2005年，我國衛生部正式批準海藻糖為新資源食品。

1993年日本林原生化研究所首次發現麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，以液化淀粉作為底物，這兩種酶協同作用，可以生成海藻糖，并且率先實現了海藻糖工業化生產。目前，我國已有公司開始生產海藻糖，但產品性能、產率與進口產品存在一定差距，并且生產成本一直居高不下。更為嚴峻的是，為了迎合市場需求，海藻糖售價不斷下降，給海藻糖生產帶來了巨大挑戰和壓力。因此如何提升海藻糖產率，實現海藻糖低成本規模化制備，使其走向大眾消費者的餐桌成為學術界和產業界關注的熱點。

目前，工業化生產海藻糖主要通過兩種方法：①利用海藻糖合成酶，以麥芽糖作為底物，通過分子內轉糖基作用，生成海藻糖；②以淀粉液化液作為底物，經麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)協同作用生產海藻糖。兩種方法海藻糖產率均為80％左右。但是，從生產成本以及周期考慮，以淀粉作為底物制備海藻糖，工藝更為簡便，成本更為低廉。因此，麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)協同作用生產海藻糖，更具優勢。

國內外雙酶法生產海藻糖包括中低溫酶系(海藻糖轉化率：Arthrobactersp.Q36：80％、Arthrobacter ramosus S34：66％，Brevibaterium helvolum：70.4％)和高溫酶系(Sulfolobus solfataricus KM1：81.5％、Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909：80.2％)。高溫酶系通常具有較高的海藻糖轉化率，并且具有良好的熱穩定性，能在較高溫度下轉化淀粉生成海藻糖，不容易在生產過程中污染雜菌。但是，高溫酶系相對于中低溫酶系，具有蛋白表達量低，比酶活低的缺點，不利于其工業化應用。

發明內容

基于上述現狀，本發明利用基因工程和酶工程的手段，提高麥芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活，為其工業化生產創造條件。

本發明提供了具有酶活提高的麥芽寡糖基海藻糖合成酶的突變體，包含了將來源于嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)的麥芽寡糖基海藻糖合成酶的第81、263、284、432、439、583、585、586、611或615位的氨基酸中的一個或多個進行取代得到的突變體。這些突變體與其親代的麥芽寡糖基海藻糖合成酶相比，酶活提高。

在本發明的一種實施方式中，所述嗜酸熱硫化葉菌(S.acidocaldarius)。

在本發明的一種實施方式中，所述來源于嗜酸熱硫化葉菌(S.acidocaldarius)的麥芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體是將第81位置的甘氨酸(Gly)變成絲氨酸(Ser)，突變體命名為G81S。