[發(fā)明專利]一種骨肉瘤異種移植小鼠模型的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910848335.1
• 申請(qǐng)日: 2019-09-09
• 公開（公告）號(hào): CN110402895A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黎志宏;陳瑞奇;段智曦;羅煦君;李文逸;黎雙慶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院
• 主分類號(hào): A01K67/027
• 分類號(hào): A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 長(zhǎng)沙歐諾專利代理事務(wù)所(普通合伙) 43234
• 代理人: 歐穎;李艷華

1.一種骨肉瘤異種移植小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括先復(fù)蘇保存在液氮環(huán)境中的骨肉瘤患者腫瘤組織塊，再在無菌條件下將復(fù)蘇的患者腫瘤組織塊異種原位移植進(jìn)免疫缺陷小鼠體內(nèi)，所述異種原位移植包括選用年齡在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性別與患者性別保持一致，將復(fù)蘇的患者腫瘤組織塊浸泡在無菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，將患者腫瘤組織塊植入小鼠的骨髓腔中，縫合小鼠皮膚上的手術(shù)切口，養(yǎng)育小鼠使得其骨髓腔中腫瘤生長(zhǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)采集到的骨肉瘤患者腫瘤組織塊進(jìn)行程序降溫和液氮保存的過程以及快速升溫復(fù)蘇的過程。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述骨肉瘤患者腫瘤組織塊保存在含DMSO、FBS和NEAA的DMEM中，三段以上程序降溫至液氮溫度，并在液氮溫度中保存，所述快速升溫復(fù)蘇是指將凍存組織放至36～38℃的恒溫水浴中進(jìn)行復(fù)蘇。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫缺陷小鼠為NOD/SCID小鼠，所述骨肉瘤患者腫瘤組織塊的單邊長(zhǎng)度小于等于3mm，優(yōu)選小于等于1mm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，原位移植時(shí)小鼠的體重為8～20g，優(yōu)選為12～15g，所述無菌孵育液中包含抗生素和胎牛血清，優(yōu)選所述無菌孵育液中包含抗生素和DMEM培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基，更優(yōu)選所述抗生素包含青霉素和鏈霉素。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將患者腫瘤組織塊植入小鼠的骨髓腔中的具體步驟包括：先在小鼠的股骨或脛骨處作皮膚切口，再用牙科鉆在小鼠脛骨處鉆孔，開孔處的脛骨被鉆摩成屑，開孔并露出骨髓后將患者腫瘤組織塊植入骨髓腔中，再縫合小鼠皮膚上的手術(shù)切口。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，養(yǎng)育小鼠待其脛骨皮膚腫脹后，所述方法還包括采用小動(dòng)物活體成像儀觀察小鼠脛骨肉瘤大小，優(yōu)選還采用小動(dòng)物活體成像儀觀察腫瘤是否轉(zhuǎn)移到小鼠的內(nèi)臟。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括養(yǎng)育小鼠使得其骨髓腔中腫瘤生長(zhǎng)后解剖小鼠，剝離瘤體得到P0代腫瘤瘤體，取P0代腫瘤瘤體異種原位移植進(jìn)免疫缺陷小鼠體內(nèi)得到P1代腫瘤瘤體，可選地取P1代腫瘤瘤體異種原位移植進(jìn)免疫缺陷小鼠體內(nèi)得到P2代腫瘤瘤體，以此類推傳代。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將部分P0代腫瘤瘤體程序降溫并保存在液氮中，以及可選地包括將部分P1和P2代腫瘤瘤體程序降溫并保存在液氮中。

10.一種骨肉瘤異種移植小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括在無菌條件下將凍存在液氮環(huán)境中并復(fù)蘇的小鼠模型中的P0代骨肉瘤腫瘤組織、P1代骨肉瘤腫瘤組織或P2代骨肉瘤腫瘤組織異種原位移植進(jìn)免疫缺陷小鼠體內(nèi)，所述異種原位移植包括選用年齡在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性別與患者性別保持一致，將所述骨肉瘤腫瘤組織塊浸泡在無菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，將所述骨肉瘤腫瘤組織塊植入小鼠的骨髓腔中，縫合小鼠皮膚上的手術(shù)切口，養(yǎng)育小鼠使得其骨髓腔中腫瘤生長(zhǎng)。