[發明專利]以LppA基因為檢測靶標進行牛支原體檢測的組合物、試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201910847999.6
• 申請日: 2019-09-09
• 公開（公告）號: CN110499376B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 李敏;郝秀靜;韓楊;馬春驥;王玉炯
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6816;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 北京北匯律師事務所 11711
• 代理人: 高元吉

1.一種用于檢測牛支原體的組合物，其特征在于，包括能夠與牛支原體的LppA基因雜交的第一寡核苷酸、第二寡核苷酸、第三寡核苷酸和溶解所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的緩沖液，其中：所述第一寡核苷酸與所述LppA基因的第一區域選擇性雜交，所述第二寡核苷酸與所述LppA基因的第二區域選擇性雜交，且所述第一區域位于所述LppA基因的5’端側，所述第二區域位于所述LppA基因的3’端側，所述第一區域與所述第二區域之間的距離在50bp-2000bp之間，所述第三寡核苷酸的3’端帶有終止磷酸基團和位于所述第三寡核苷酸中間第31至32的THF切割位點，所述第一寡核苷酸的序列如SEQ?ID?No.2所示，所述第二寡核苷酸的序列如SEQ?ID?No.3所示，其序列為(Biotin)TAGTAAGCGAGCCGTAAAACGGATAAACTATAGC?TTTG，所述第三寡核苷酸的序列如SEQ?ID?No.4所示，其序列為(FAM)CAAGCATAAATAATCCAAATAAGCTACGTTT/idSp/GTCAGGTATTTGTTTAC(P)，所述緩沖液的pH為6.9-7.0，且所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸在所述緩沖液中的濃度各自分別為0.5-1μmol/L。

2.根據權利要求1所述的用于檢測牛支原體的組合物，其特征在于，所述LppA基因的序列如SEQ?ID?No.1所示。

3.根據權利要求1所述的用于檢測牛支原體的組合物，其特征在于，所述第三寡核苷酸與所述LppA基因的第三區域選擇性雜交，所述第三區域位于所述第一區域和所述第二區域之間。

4.根據權利要求3所述的用于檢測牛支原體的組合物，其特征在于，所述第一寡核苷酸的長度為35-45nt；所述第二寡核苷酸的長度為35-50nt；所述第三寡核苷酸的長度為40-55nt。

5.一種用于檢測牛支原體的試劑盒，其特征在于，包括根據權利要求1-4任一項所述的組合物。

6.試劑在制備用于通過下述方法檢測牛支原體的試劑盒中的用途，其特征在于，所述試劑包括權利要求1-4任一項所述的組合物；

檢測方法包括以下步驟：

(1)提供來源于牛的生物樣本的模板；

(2)使所述模板與根據權利要求1-4任一項所述的組合物組成反應體系，在34℃～42℃下使所述反應體系反應5～20分鐘得到擴增產物；

(3)檢測擴增產物。

7.根據權利要求6所述的用途，其特征在于，所述檢測擴增產物包括使擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳的步驟。

8.根據權利要求7所述的用途，其特征在于，所述檢測擴增產物包括使擴增產物與帶有標記的測流層析試紙條接觸，當在檢測線和質控線處都顯示紅色時，判定所述生物樣本為陽性樣本，當在質控線處顯示紅色而檢測線未顯色時，判定所述生物樣本為陰性樣本，當質控線不顯示紅色時證明試紙條失效。