[發明專利]用于序列操縱和治療應用的系統、方法和組合物的遞送、工程化和優化

在審

• 申請號: 201910837608.2
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN110872583A
• 公開（公告）日: 2020-03-10
• 發明（設計）人: F.張;M.海登雷希;F.藍;L.斯維奇
• 申請（專利權）人: 布羅德研究所有限公司;麻省理工學院;哈佛大學校長及研究員協會
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/113;C12N15/864;C12N15/867;C12N5/10;C12N15/90;A61K31/7088;A61P35/00;A61P35/02;A61P29/00;A61P37/02;A61P3/00;A61P1/16;A61P25/
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平;袁元

1.一種工程化組合物，其包含：

Cas9蛋白；

CRISPR-Cas系統指導RNA，其包含：

(a)指導序列，所述指導序列能夠在真核細胞中雜交到與原型間隔子鄰近基序(PAM)相鄰的靶序列上并指導CRISPR復合物與所述靶序列的序列特異性結合，和

(b)tracr配對序列，所述tracr配對序列能夠與tracr序列雜交；和

包含所述tracr序列的tracrRNA。

2.一種工程化組合物，其包含：

Cas9蛋白；和

CRISPR-Cas系統嵌合RNA(chiRNA)，其包含：

(a)指導序列，所述指導序列能夠在真核細胞中雜交到與原型間隔子鄰近基序(PAM)相鄰的靶序列上并指導CRISPR復合物與所述靶序列的序列特異性結合，

(b)tracr配對序列，所述tracr配對序列能夠與tracr序列雜交，和

(c)所述tracr序列，其具有30個或更多個核苷酸，

其中(a)、(b)和(c)以5'至3'方向排列。

3.一種工程化組合物，其包含一個或多個載體，所述一個或多個載體包含與編碼Cas9蛋白的核苷酸序列、CRISPR-Cas系統指導RNA和包含tracr序列的tracrRNA可操作地連接的一個或多個調節元件，所述CRISPR-Cas系統指導RNA包含：

(a)指導序列，所述指導序列能夠在真核細胞中雜交到與原型間隔子鄰近基序(PAM)相鄰的靶序列上并指導CRISPR復合物與所述靶序列的序列特異性結合，和

(b)tracr配對序列，所述tracr配對序列能夠與所述tracr序列雜交。

4.一種工程化組合物，其包含一個或多個載體，所述一個或多個載體包含與編碼Cas9蛋白和CRISPR-Cas系統嵌合RNA(chiRNA)的一個或多個核苷酸序列可操作地連接的一個或多個調節元件，所述chiRNA包含：

(a)指導序列，所述指導序列能夠在真核細胞中雜交到與原型間隔子鄰近基序(PAM)相鄰的靶序列上并指導CRISPR復合物與所述靶序列的序列特異性結合，

(b)tracr配對序列，所述tracr配對序列能夠與tracr序列雜交，和

(c)所述tracr序列，其具有30個或更多個核苷酸，

其中(a)、(b)和(c)以5'至3'方向排列。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，其還包含修復模板。

6.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，其中所述Cas9蛋白與一個或多個核定位序列(NLS)連接或融合。

7.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，其中所述Cas9蛋白與兩個或更多個核定位序列(NLS)連接或融合。

8.根據權利要求6所述的組合物，其中至少一個NLS位于所述Cas9蛋白的氨基端處或附近，并且至少一個NLS位于所述Cas9蛋白的羧基端處或附近。

9.根據權利要求3或4所述的組合物，其中所述編碼Cas9蛋白的核苷酸序列經密碼子優化以在真核細胞中表達。

10.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，其中所述指導序列的長度為至少15個核苷酸。

11.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，其中所述tracr序列的長度為至少40個核苷酸。

12.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，其中所述tracr序列的長度為至少50個核苷酸。

13.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，其中所述Cas9蛋白是核酸酶。