[發(fā)明專利]基于雙匙解鎖機(jī)制檢測(cè)miRNA的試劑盒及應(yīng)用在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201910829152.5 | 申請(qǐng)日： | 2019-09-03 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN110643683A | 公開（公告）日： | 2020-01-03 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 常津;彭偉盼;宮曉群 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 天津大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12Q1/682 | 分類號(hào)： | C12Q1/682 |
| 代理公司： | 12107 天津市三利專利商標(biāo)代理有限公司 | 代理人： | 楊歡 |
| 地址： | 300072*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 探針 熒光編碼 試劑盒 富集 氨基化 偶聯(lián) 鎖狀 羧基化聚苯乙烯微球 雙鏈特異性核酸酶 編碼技術(shù) 熒光微球 單鏈DNA 納米球 雙重解 羧基化 檢測(cè) 分檢 解鎖 莖環(huán) 擴(kuò)增 流式 應(yīng)用 研究 | ||
1.一種基于“雙匙解鎖機(jī)制”檢測(cè)miRNA的試劑盒，其特征在于，包括熒光編碼“鎖狀”探針、信號(hào)富集探針以及雙鏈特異性核酸酶；所述的熒光編碼“鎖狀”探針為氨基化莖環(huán)DNA與羧基化熒光編碼納米球偶聯(lián)得到；所述的信號(hào)富集探針為氨基化單鏈DNA與羧基化聚苯乙烯微球偶聯(lián)得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于“雙匙解鎖機(jī)制”檢測(cè)miRNA的試劑盒，其特征在于，所述的偶聯(lián)劑為EDC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于“雙匙解鎖機(jī)制”檢測(cè)miRNA的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒采用下述方法使用：
1)“雙鑰解鎖”及靶標(biāo)循環(huán)回收：miRNA與所述的熒光編碼“鎖狀”探針中的莖環(huán)DNA互補(bǔ)配對(duì)，然后加入雙鏈特異性核酸酶特異性切割雜交鏈中的DNA，在miRNA/DSN“雙鑰”作用下，解鎖熒光編碼“鎖狀”探針，并引發(fā)靶標(biāo)循環(huán)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大；
2)信號(hào)富集擴(kuò)增及流式微球定量：解鎖的熒光編碼探針中的DNA單鏈與所述的信號(hào)富集探針中DNA單鏈互補(bǔ)配對(duì)，將熒光信號(hào)富集于比表面積較大的聚苯乙烯微球表面，實(shí)現(xiàn)信號(hào)富集擴(kuò)增；無需多次清洗純化步驟，直接將富集熒光信號(hào)的聚苯乙烯微球進(jìn)行流式分析，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于“雙匙解鎖機(jī)制”檢測(cè)miRNA的試劑盒，其特征在于，所述的熒光編碼“鎖狀”探針的制備具體的包括下述步驟：將羧基化熒光納米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液按照摩爾比為1：1-4比例混合于磷酸緩沖液中，渦旋儀上低速旋轉(zhuǎn)使其混勻，然后將上述混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混合架上，室溫下反應(yīng)15-30分鐘，然后加入氨基化莖環(huán)DNA，室溫下反應(yīng)過夜；反應(yīng)結(jié)束后，采用離心分離進(jìn)行純化，用PBS緩沖液至少清洗三次以除去未反應(yīng)的莖環(huán)DNA，得到熒光編碼“鎖狀”探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于“雙匙解鎖機(jī)制”檢測(cè)miRNA的試劑盒，其特征在于，所述的信號(hào)富集探針采用下述方法制備：(1)將羧基化聚苯乙烯微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽水溶液按照摩爾比為1：1-4比例混合于磷酸緩沖液中，渦旋儀上低速旋轉(zhuǎn)使其混勻，然后將上述混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混合架上，室溫下反應(yīng)15-30分鐘，然后加入氨基化單鏈DNA，室溫下反應(yīng)過夜；反應(yīng)結(jié)束后，采用離心分離進(jìn)行純化，用PBS緩沖液至少清洗三次以除去未反應(yīng)的單鏈DNA，得到信號(hào)富集探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于“雙匙解鎖機(jī)制”檢測(cè)miRNA的試劑盒，其特征在于，“雙鑰解鎖”及靶標(biāo)循環(huán)回收的具體步驟為：將熒光編碼“鎖狀”探針、待檢miRNA按照體積比為1-3:1比例混合于磷酸緩沖液中，加入0.1-0.6U雙鏈特異性核酸酶及10×雙鏈特異性核酸酶緩沖液，渦旋儀上低速旋轉(zhuǎn)使其混勻，然后將上述混合溶液置于金屬浴中，35-60℃下反應(yīng)20-120分鐘，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)循環(huán)回收及信號(hào)放大。反應(yīng)結(jié)束后，加入終止液，45℃反應(yīng)5分鐘，使酶失活。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于“雙匙解鎖機(jī)制”檢測(cè)miRNA的試劑盒，其特征在于，富集擴(kuò)增及流式微球定量的具體步驟為：加入信號(hào)富集探針加入5-30微升，使DNA進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)富集，并用流式進(jìn)行微球熒光定量分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的基于“雙匙解鎖機(jī)制”檢測(cè)miRNA的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，用于檢測(cè)miRNA-21、miRNA-141或者混合同檢。
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