[發明專利]高通量自動化的微生物宏基因組16s rRNA基因文庫構建的方法

在審

• 申請號: 201910826851.4
• 申請日: 2019-09-03
• 公開（公告）號: CN110592682A
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發明（設計）人: 張鴻;張慧;劉詩燕
• 申請（專利權）人: 張鴻
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了高通量自動化的微生物宏基因組16s rRNA基因文庫構建的方法，具體涉及分子生物學領域，具體步驟如下：S1、配制反應液；S2、設置儀器參數；S3、芯片制備；S4、PCR擴增；S5、離心回收；S6、瓊脂糖凝膠電泳回收；S7、文庫質控。本發明通過一種利用MSND自動化平臺構建文庫的方法，可以同時進行384個樣本的建庫，大大提升了芯片制備的通量和效率，實現了儀器自動化，節省了人力，提高了建庫的通量、減少了實驗成本、降低了樣本的起始量，本方法僅需要切膠回收后的樣本進行一次qPCR定量即可直接上機測序，更為高效，節約了試劑使用量并省去了繁瑣的質控、pooling等步驟，仍能獲得和常規建庫方法一致的測序結果。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，更具體地說，本發明涉及高通量自動化的微生物宏基因組16s rRNA基因文庫構建的方法。

背景技術

隨著二代測序技術的快速發展，16S rRNA基因測序成為了細菌群落物種組成及群落多樣性研究的常規方法，包括經典的16s rRNA基因高變區區域測序(基于illuminaMiseq平臺)和全長測序(基于Sequel和MinION平臺)。目前應用比較廣泛的測序區域是16srRNA基因的V3-V4區域，通過和其它研究手段相結合，在微生物組學的研究中發揮了重要作用。

常規的16s rRNA基因的文庫構建，是通過帶有接頭序列和index序列的PCR引物擴增其V3-V4區域，然后通過illumina平臺進行測序。這種方法對于少量樣本而言，操作簡便，測序結果較好，價格偏低。隨著微生物研究的逐漸深入以及測序價格的降低，目前出現了很多基于大量樣本的群體進行分析的微生物群落研究。常規的16s rRNA基因的文庫構建方法對于需要大量同時處理的樣本而言，建庫過程繁瑣，周期長，成本相對較高。

因此，需要一種高通量、低成本、速度快、質量好的建庫方案來解決以上問題。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本發明的實施例提供高通量自動化的微生物宏基因組16s rRNA基因文庫構建的方法，通過MSND平臺以一張含有5184個反應孔的芯片作為載體，一次可以同時處理384個樣本(每個樣本12個技術重復)，另外每個反應孔的反應體系為100納升，大大節約了試劑和樣本使用量；通過使用帶有接頭序列的內引物選擇性擴增特定區域DNA片段，再由帶有barcode序列及適用于illumina平臺測序的接頭序列的外引物進行擴增，擴增結束后使用收集裝置獲得可直接用于測序的文庫。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：高通量自動化的微生物宏基因組16srRNA基因文庫構建的方法，具體步驟如下：

S1、配制反應液：取一個干凈的384孔PCR板，在孔內配制芯片制備的反應液：

配制完反應液后，用移液器吹打混勻，然后離心備用；

S2、設置儀器參數：將MSND儀器的模式調為384×12模式，其中384代表384個樣本，12代表12次重復實驗；

S3、芯片制備：將配置好的384孔板放入MSND儀器內，同時將SmartChip芯片也放入到儀器中對應的位置，點擊開始自動化點樣儀MSND將自動把384孔板中的文庫構建所需的PCR反應體系噴液到5184孔SmartChip芯片上；待儀器運行完成，將SmartChip芯片取下，蓋上封口膜放到冰盒上備用；

S4、PCR擴增；

S4.1、設置PCR儀的擴增程序；

S4.2、然后將PCR程序設置為“蓋子加熱到105℃”；

S4.3、PCR儀設置完成之后，將SmartChip芯片放到PCR儀上，蓋上蓋子進行PCR擴增；

S5、離心回收；