[發明專利]一種從豬肺中分離提純血管緊張素轉化酶的方法

在審

• 申請號: 201910813930.1
• 申請日: 2019-08-30
• 公開（公告）號: CN110551704A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 曹敏杰;肖盼盼;章騫;翁凌;劉光明
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48
• 代理公司: 35218 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司
• 代理人: 秦華

本發明公開了一種從豬肺中分離提純血管緊張素轉化酶的方法。該方法包括豬肺的預處理得到一級上清液S₁；再調pH至酸性，于水浴中靜置,離心，絹布過濾，取上清液得二級上清液S₂；再鹽析加入固體鹽，攪拌后靜置，離心，絹布過濾，得三級上清液S₃，緩慢加入鹽，攪拌后靜置，離心，收集沉淀溶于置于緩沖液中得到粗血管緊張素轉化酶溶液；超濾膜分離，收集未透過液即為高純度的血管緊張素轉化酶。本發明的方法分離效果好，工藝簡單，耗時短，成本低，極具工業應用前景。

技術領域

本發明涉及物質分離提純領域，具體涉及一種從豬肺中分離提純血管緊張素轉化酶的方法。

背景技術

隨著經濟的快速發展和人們生活習慣的改變，慢性非傳染性疾病已成為影響人民健康的公共衛生問題。高血壓是一種非傳染性的慢性疾病，對于中風，心力衰竭和冠狀動脈疾病的患者，高血壓是一個非常重要的風險因素。據來自195個國家和地區的數據估計，2015年，有8.74億成年人的收縮壓(SBP)為140毫米汞柱或更高。預計，到2025年全世界將有約15.6億人患有高血壓。高血壓現已成為全球主要的健康問題。高血壓病理基礎中，血管緊張素及緩激肽在腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)對血壓穩態調節具有重要作用，同時激肽釋放酶-激肽系統(kallikrein kinin system，KKS)與之關系密切，協同調節血壓。

在RAS系統中，血管緊張素轉化酶(ACE)是最為重要的調控酶。ACE廣泛存在于哺乳動物不同組織中，其中肺毛細血管內皮細胞ACE活性最高。ACE可將無活力的血管緊張素I(AngI)轉化為能使血管收縮的血管緊張素II(AngII)，同時將緩激肽降解為無活性的片段，是高血壓治療藥物篩選中的關鍵酶。

商品化ACE價格昂貴，不利于ACE抑制肽研究的順利進行，且目前ACE的分離純化主要采用硫酸銨分級沉淀，親和層析，離子交換柱層析，羥基磷灰石柱層析，凝膠過濾層析相結合的方法進行，獲得的ACE的純度不夠高，分離提純過程繁瑣，操作復雜，耗時長，且成本高。

CN 108977423A公開了一種利用氯化鈉鹽析、DEAE陰離子交換柱層析的方法從豬肺中分離提純血管緊張素轉換酶的制備工藝。該專利申請利用氯化鈉鹽析除去雜蛋白，鹽析過程中需要多次離心，操作較繁瑣且降低了目的蛋白的得率。除此之外，DEAE陰離子交換柱層析的方法耗時長，成本高且損失多。

發明內容

針對上述問題，本發明的發明人經過深入研究之后發現，采用酸沉淀的方法能夠加快純化速度，耗時短，成本低，得率高且所得粗酶液中含有更少的雜蛋白及更高純度的目的蛋白。相較于氯化鈉鹽析技術，本發明選用的硫酸銨鹽析技術，操作簡單，目的蛋白的得率高。相較于透析，本發明選用的超濾分離技術耗時短，可一步實現雜蛋白的去除和目的蛋白的濃縮。本發明的酸沉淀、硫酸銨鹽析、超濾分離的組合技術可獲得高純度(考染級別的電泳純)的血管緊張素轉化酶，基于此，完成了本發明。

為實現上述目的，本發明提供一種從豬肺中分離提純血管緊張素轉化酶的方法，其特征在于，該方法包括：

預處理：將豬肺洗凈并去除肺官及外層膜組織，低溫冷卻后置于緩沖液中組織勻漿，然后加入促滲劑，在低溫下攪拌，過濾取濾液，濾液離心取上清，得一級上清液S₁；

酸沉淀：將所述一級上清液S₁調pH至酸性，于水浴中靜置,離心，絹布過濾，取上清液得二級上清液S₂；

鹽析：向所述二級上清液S₂中緩慢加入固體鹽，攪拌后靜置，離心，絹布過濾，得三級上清液S₃，向所述三級上清液S₃中緩慢加入鹽，攪拌后靜置，離心，收集沉淀溶于置于緩沖液中得到粗血管緊張素轉化酶溶液；