[發(fā)明專利]一種視網(wǎng)膜血管瘤樣增生和/或視網(wǎng)膜毛細(xì)血管瘤模型構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910795874.3
• 申請(qǐng)日: 2019-08-27
• 公開（公告）號(hào): CN110463663B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳大年;肖麗容;魏然;孔虹雨;王鈺嬌;梁晨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)華西醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發(fā)明公開了一種視網(wǎng)膜血管瘤樣增生和/或視網(wǎng)膜毛細(xì)血管瘤小鼠模型，它是將Cre小鼠、Rb floxed小鼠和Vhl floxed小鼠雜交后獲得的基因敲除小鼠。本發(fā)明Rb/Vhl雙敲除小鼠模型周邊部視網(wǎng)膜存在大量新生血管，這些血管穿透全層，形成致密的毛細(xì)血管網(wǎng)，并且失去了正常的視網(wǎng)膜三層血管網(wǎng)的分層結(jié)構(gòu)。這些表型比現(xiàn)有技術(shù)中的RAP模型的視網(wǎng)膜新生血管更嚴(yán)重；Rb/P107/Vhl TKO小鼠周邊部視網(wǎng)膜仍然存在一些新生血管，但在視網(wǎng)膜下形成了明顯的III期RAP和RCH樣病變。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明具體涉及一種視網(wǎng)膜血管瘤樣增生和/或視網(wǎng)膜毛細(xì)血管瘤模型構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

視網(wǎng)膜血管性疾病是最常見的眼底疾病，由于發(fā)病機(jī)制不清，一直是眼科臨床工作的重點(diǎn)及難點(diǎn)。視網(wǎng)膜血管瘤樣增生(RAP)和視網(wǎng)膜毛細(xì)血管瘤(RCH)是該類疾病的重要代表。臨床上RAP分成三期，包括視網(wǎng)膜內(nèi)新生血管期(I期)、視網(wǎng)膜下新生血管期(II期)和脈絡(luò)膜新生血管期(III期)。病理上晚期RAP呈血管瘤樣生長(zhǎng)，類似于RCH。

RAP和RCH分別發(fā)生于老年和青壯年，病理上非常相似，主要特征就是“瘤體”主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞和泡沫狀間質(zhì)細(xì)胞組成，其中間質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是真正的“腫瘤細(xì)胞”；發(fā)病機(jī)制目前均不清楚，其防治困難重重。為了深入研究RAP/RCH發(fā)病機(jī)制，迫切需要建立合適的動(dòng)物模型對(duì)此展開研究，以測(cè)試新的藥物和治療方法。國(guó)際上對(duì)此進(jìn)行了近20年的探索，但尚未取得重大突破。

關(guān)于RAP模型，1997年Okamoto等(Okamoto et al.,1997)構(gòu)建了在外核層特異性高表達(dá)VEGF的轉(zhuǎn)基因小鼠，這些小鼠視網(wǎng)膜在外核層可出現(xiàn)新生血管，部分可向視網(wǎng)膜下生長(zhǎng)；2000年Smith等觀察到16號(hào)染色體的Bst位點(diǎn)突變可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管(Smithet al.,2000)；2003年Heckenlively等發(fā)現(xiàn)極低密度脂蛋白受體(vldlr)缺失的小鼠，可以出現(xiàn)視網(wǎng)膜內(nèi)的新生血管，成為被廣泛使用的RAP模型(Heckenlively et al.,2003)；2013-2014年，Weinl(Weinl et al.,2013)和Hasegawa(Hasegawa et al.,2014)又分別報(bào)道了2個(gè)突變小鼠(Srf-/-和NRV2)可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)的新生血管，部分可以向視網(wǎng)膜下生長(zhǎng)。這些小鼠形成的視網(wǎng)膜新生血管與I-II期RAP相似，可能與局部VEGF上調(diào)有關(guān)。但其新生血管較少，沒有明顯的基質(zhì)細(xì)胞，后期并未形成血管瘤樣復(fù)合體，和人RAP的臨床病理改變有很大差異，并非理想的RAP動(dòng)物模型。

關(guān)于RCH模型，由于人類RCH是由VHL基因突變引起的，2001年Haase等構(gòu)建了Vhl基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)Vhl-/-小鼠胚胎期就已死亡，而Vhl+/-小鼠沒有RCH或中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管瘤(Haase et al.,2001)；2010年后，多種視網(wǎng)膜特異性的Vhl基因敲除小鼠被構(gòu)建，但均無RCH形成，反而發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管發(fā)育遲緩(Arreola et al.,2018；Barben et al.,2018；Kurihara et al.,2010；Lange et al.,2011；Usui et al.,2015)。2018年，Wang等(Wanget al.,2018)在血管母細(xì)胞中敲除Vhl基因，發(fā)現(xiàn)可以導(dǎo)致類似于早期RCH的病變，包括視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張、血管滲漏等，但病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)血管瘤樣結(jié)構(gòu)及視網(wǎng)膜新生血管形成。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種視網(wǎng)膜血管瘤樣增生和/或視網(wǎng)膜毛細(xì)血管瘤模型的構(gòu)建方法，它是將動(dòng)物的Rb和Vhl基因敲除，或?qū)?dòng)物的Rb、p107和Vhl基因敲除得到動(dòng)物模型。

進(jìn)一步地，所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為小鼠或者大鼠。

更進(jìn)一步地，它是將Cre小鼠與Vhl floxed小鼠雜交，得到的Vhl基因敲除小鼠作為F1代，再與Rb floxed小鼠雜交，得到的F2代，即為Rb和Vhl基因敲除的模型。