[發明專利]一種冷凍保護液和含有其的細胞凍存液及其在細胞凍存中的應用

有效

• 申請號: 201910792520.3
• 申請日: 2019-08-26
• 公開（公告）號: CN110432259B
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 竇蒙家;饒偉
• 申請（專利權）人: 中國科學院理化技術研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

本發明涉及一種冷凍保護液和含有其的細胞凍存液及其在細胞凍存中的應用。所述冷凍保護液包括：L?脯氨酸和海藻糖，所述L?脯氨酸和所述海藻糖摩爾比為4～10:1。本發明所提供的細胞凍存液采用生物相容性更好的L?脯氨酸和海藻糖，在使用時可以直接將凍存管保存于液氮中，節省大量時間，同時可以保證較高的細胞復蘇率，特別是紅細胞，可以達到80～90％；本發明細胞凍存液凍存后的細胞形態結構和生理功能維持穩定，細胞膜上的各功能性蛋白活性保持不變。

技術領域

本發明涉及細胞生物學領域，尤其涉及一種冷凍保護液和含有其的細胞凍存液及其在細胞凍存中的應用。

背景技術

細胞凍存是現有生物學領域的一項常規技術，在購買的細胞經過傳代后，一般需要將其中的一部分凍存起來，以作備用，可以用來重復實驗，也可以在需要時復蘇細胞，一部分拿來實驗，另一部分繼續傳代凍存，是實驗室的一種資源。同時也有很多實驗在構建特定的細胞株后需要凍存一部分，以便重復使用。細胞在凍存時大量水分從細胞器中滲出，在低溫條件下形成冰晶，從而對細胞本身造成損害。

現有技術為了克服細胞在低溫狀態下易形成冰晶的缺陷，在細胞凍存液中使用甘油或二甲基亞砜(DMSO)作為冷凍保護劑，提高細胞膜對水的透過性，細胞在低溫條件下，部分水分滲出，形成的冰晶較少；同時，細胞在凍存時需要采用“慢凍速融”的方法，以便于細胞內的水分可以充分地滲出，避免形成較大的冰晶。但是，現有凍存方法仍存在著一定的缺陷，以此方法凍存的細胞難免在結構和功能方面出現損傷，在復蘇時，往往一部分細胞仍會死亡，而存活下來的細胞有時也需培養一段時間后恢復狀態和活性。

而對于某些較為脆弱的細胞，由于其本身特殊的性質，在其凍存過程中細胞凍存液和凍存方法的選擇更為重要，例如紅細胞，紅細胞目前被廣泛用于外科手術補充失血和治療貧血等疾病中。目前各大血站通常采用ACD，CPD，CPDA-1保存液將血液保存在4℃下，雖然能夠基本保證一般情況下的臨床用血需求，但是這種傳統的保存方法保存時間短，通常可以保存3周，運輸困難且受氣溫影響比較大，對于緊急情況下的大量用血以及偏遠地區的用血需求就難以保障。此外，目前有采用甘油低溫冷凍保存方法，能夠保存紅細胞長達10年之久，但是由于需要高濃度的甘油來保障紅細胞經歷降溫及升溫過程后仍然存活，所以在復蘇紅細胞后需要一系列復雜的耗時耗力的去甘油化過程，紅細胞才能被用于輸注。

發明內容

本發明提供一種冷凍保護液和含有其的細胞凍存液及其在細胞凍存中的應用，用以解決現有技術中細胞凍存步驟繁瑣，凍存后細胞結構和功能難以保持的問題。

第一方面，本發明提供一種冷凍保護液，包括：L-脯氨酸和海藻糖，所述L-脯氨酸和所述海藻糖摩爾比為4～10:1。

L-脯氨酸可以滲透到細胞內，減少細胞酸性，調整細胞的氧化還原勢能，穩定蛋白質及其他生物大分子，海藻糖的性質十分穩定，可以在細胞膜表面形成保護膜，有效保持蛋白質分子不變形，維持細胞的生命特征和生物過程。本發明將此兩者進行搭配，并限定其濃度使得其制成的凍存液效果在很大程度上得到提升，在凍存細胞時減少形成冰晶的數量和大小，可以不用常規的“慢凍”過程，直接置于液氮中保存也可以保持較高的細胞存活率。

進一步地，所述L-脯氨酸和所述海藻糖摩爾比為4～8:1。

進一步地，所述L-脯氨酸和所述海藻糖在細胞凍存液中終濃度為：L-脯氨酸1～2mol/L，海藻糖0.2～0.3mol/L。

第二方面，本發明提供一種細胞凍存液，包括上述冷凍保護液和基礎液。

進一步地，所述基礎液為PBS、0.9％NaCl、1×DMEM basic和杜氏磷酸緩沖液中的一種或多種，優選為杜氏磷酸緩沖液。