[發明專利]一種豬干擾素α突變體YNS及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201910779232.4
• 申請日: 2019-08-22
• 公開（公告）號: CN110437328B
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 梁秀麗;張紅壘;魏戰勇;夏璐;王朋濤;張福良;王雪平;龍福慶;張春霞;盧川原
• 申請（專利權）人: 安陽工學院
• 主分類號: C07K14/56
• 分類號: C07K14/56;C12N15/21;C12N15/70;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;A61K38/21;A61P31/12;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 冉珊敏

本發明屬于干擾素領域，涉及突變體干擾素的制備，特別是指一種豬干擾素α突變體YNS及其制備方法和應用。利用基因工程方法，將天然豬α干擾素基因進行改造，改造的氨基酸位點為H58→Y、E59→N及L61→S，將改造后的基因克隆到pET?32a載體上構建重組質粒；然后分析豬α干擾素基因的密碼子偏嗜性，將鑒定正確的重組質粒克隆到Rosetta表達菌中誘導表達和鑒定。重組蛋白以包涵體形式表達，經純化和透析處理后，獲得純度較高的豬α干擾素。檢測蛋白對Vero細胞的毒性和抗病毒活性，試驗結果表明所得的YNS突變體蛋白的CC50為549.5ug/mL，其抗病毒活性為4.29×10⁶U/mg。

技術領域

本發明屬于干擾素領域，涉及突變體干擾素的制備，特別是指一種豬干擾素α突變體YNS及其制備方法和應用。

背景技術

近年來，我國的養豬業迅速發展，養豬模式也從傳統養殖向規模化、集約化模式轉變，各種疾病不斷頻發，尤其是病毒性疾病對養豬業造成不可估量的經濟損失，嚴重制約我國養豬業蓬勃發展。對于像藍耳病、豬瘟、口蹄疫等疾病，由于免疫程序、疫苗本身、生長環境和不同動物個體等原因，使疫苗免疫效果往往不理想，加之病毒不斷變異，接種預防作用越來越不明顯，目前還沒有高效疫苗來預防病毒的蔓延。另一方面疫苗預防也存在危險，不少弱毒疫苗在使用過程中出現毒力返祖現象，使預防效果大打折扣，而且還干擾疾病的診斷；不少地區存在抗生素濫用的現象，造成一些抗藥菌株的產生，給疾病預防和人類健康造成極大危險。因此，一種有效且對環境無污染的生物制劑對于預防和治療豬病毒病迫在眉睫。干擾素具有廣譜的抗病毒活性，特別是α-干擾素效果最顯著，可以有效抑制病毒的復制，在生產應用方面前景廣闊。

豬α干擾素基因全長570bp，編碼189個氨基酸，其中前23個氨基酸構成信號肽，剩余166個氨基酸構成其成熟蛋白。許多學者對豬干擾素α進行研究，許多的干擾素基因被克隆并在不同的表達系統中進行表達。對于哺乳動物細胞表達系統，其表達的干擾素能夠正確的發揮其生物活性，但細胞轉染效率低及篩選穩定表達的細胞系難度大等是其常見的難題，而且其蛋白產量低、成本高、耗時長等制約其大規模推廣應用；迄今為止，許多學者表達豬α干擾素均采取原核表達系統，其遺傳背景清楚、成本低及表達量高等優點被廣泛應用。陳濤（2002）、謝海艷（2004）、曹瑞兵（2004）、曾翠萍（2008）、及陳雪梅（2009）等將豬α干擾素克隆到原核表達載體上，利用TPTG誘導表達豬α干擾素，蛋白均以包涵體的形式存在。包涵體蛋白沒有生物活性，容易造成蛋白的錯誤折疊，需要通過強變性溶劑溶解及復性處理才能獲得有活性的蛋白，而且會造成蛋白的大量損失；在原核表達系統中也有學者獲得了可溶性的豬α干擾素：夏俊保（2009）、蔡家利（2013）等，然而運用誘導劑誘導的生產方法，成本高，易污染，無法大范圍推廣，因此基因工程方法表達豬α干擾素成為研究熱點，對豬α干擾素的臨床應用有重要意義。

發明內容

為提高豬干擾素α的生物活性，本發明提出一種豬干擾素α突變體YNS及其制備方法和應用，通過將天然豬α干擾素的第58位組氨酸H、59位谷氨酸E及61位亮氨酸L分別突變為酪氨酸Y、天冬氨酸N及絲氨酸S，克隆到pET-32a載體上，誘導表達后蛋白以包涵體形式存在，生物活性明顯提高。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種豬干擾素α的突變體，所述突變體與天然豬干擾素α蛋白相比氨基酸突變位點為H₅₈→Y₅₈、E₅₉→N₅₈及L₆₁→S₅₈。

所述突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

編碼豬干擾素α突變體YNS的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

含有所述的基因的重組表達載體。

所述的豬干擾素α突變體YNS的制備方法，步驟如下：