[發明專利]一種端粒長度檢測試劑盒與方法及生物學年齡評價方法

在審

• 申請號: 201910779141.0
• 申請日: 2019-08-22
• 公開（公告）號: CN110408684A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 張穎;聶蘇秦;俞瑞卿;高思欣
• 申請（專利權）人: 陜西九州醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 吳甘棠

1.一種用于端粒長度檢測的試劑盒，其特征在于，包括：

端粒基因引物序列：

正向引物：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT，

反向引物：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT；

內參基因引物序列：所述內參基因為β-globin：

正向引物：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC，

反向引物：CACCAACTTCATCCACGTTCACC。

2.根據權利要求1所述的用于端粒長度檢測的試劑盒，其特征在于，還包括內部質控標準品及陰性對照，其中陰性對照為去離子水。

3.根據權利要求1所述的用于端粒長度檢測的試劑盒，其特征在于，還包括用于自動計算生成實驗的平均校準因子并計算得到各檢測樣本的校準T/S值的計算系統。

4.根據權利要求3所述的用于端粒長度檢測的試劑盒，其特征在于，其內部質控體系的建立及平均校準因子計算方法如下：

a.隨機選取5例樣本，如D01-D05作為質控品樣本，完成至少7次qPCR實驗，記錄每次實驗中的Ct內參及Ct端粒值；

b.計算各質控樣本在每次實驗中的T/S ratio＝2^{-(Ct端粒-Ct內參)}；

c.計算至少7次實驗中各質控品樣本T/S ratio平均值，即為各質控樣本的T/S標準值；

d.計算每個質控品樣本的校準因子：

D01校準因子＝(T/S ratio)/(T/S ratio平均值)；

e.計算某次實驗的平均校準因子：5個質控樣本校準因子的平均值即為該次實驗的平均校準因子；

f.計算實驗樣本的校準T/S ratio：樣本的校準T/S ratio＝(T/S ratio)/該次實驗的平均校準因子。

5.根據權利要求4所述的用于端粒長度檢測的試劑盒，其特征在于，所述內參基因的qPCR反應體系包含：

2× SYBR Green I qPCR Mix 10μL；

內參基因正向引物 0.8μL；

內參基因反向引物 0.8μL；其中，所述內參基因正向引物和內參基因反向引物的濃度均為10μmol/L；

50×ROX Reference DyeII 0.4μL；

H₂O 6μL；

基因組DNA 2μL，其中基因組DNA的濃度為10ng/μL。

6.根據權利要求5所述的用于端粒長度檢測的試劑盒，其特征在于，所述內參基因的qPCR反應條件如下：

96℃預變性1min；95℃變性15s，58℃退火1s，72℃延伸20s，預擴增循環8次，不采集熒光；96℃變性1s，58℃退火1s，72℃延伸20s，83℃延伸30s，循環35次并在83℃延伸結束后采集熒光；熔解曲線溫度區間為60℃-95℃。

7.根據權利要求6所述的用于端粒長度檢測的試劑盒，其特征在于，所述端粒基因的qPCR反應體系包含：

2× SYBR Green I qPCR Mix 10μL；

端粒基因正向引物 0.8μL；

端粒基因反向引物 0.8μL；其中，端粒基因正向引物和端粒基因反向引物的濃度均為10μmol/L；

50×ROX Reference DyeII 0.4μL；

H₂O 6μL；

基因組DNA 2μL，其中基因組DNA的濃度為10ng/μL。

8.根據權利要求7所述的用于端粒長度檢測的試劑盒，其特征在于，所述端粒基因的qPCR反應條件如下：

96℃預變性1min；96℃變性1s，54℃退火及延伸1min，循環30次并采集熒光；熔解曲線溫度區間為60℃-95℃。

9.一種基于權利要求4-8任一所述的用于端粒長度檢測的試劑盒的生物學年齡評價方法，其特征在于，步驟如下：

(1)依據試劑盒內部質控體系的建立及平均校準因子計算方法，建立中國人口端粒長度檢測校準T/S數據庫，并繪制校準T/S值-年齡分布圖，同時標記5％，10％，25％，50％，75％，90％，95％的數據分布區間；

(2)依據上述端粒長度校準T/S值-年齡模型分布圖，擬合算法，建立端粒長度-生物學年齡的算法模型系統；利用該系統進行生物學年齡計算，并給出端粒長度在人群中的分布情況。