[發明專利]一種重組酯酶、基因、工程菌及拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的應用

有效

• 申請號: 201910766521.0
• 申請日: 2019-08-20
• 公開（公告）號: CN110592045B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 章銀軍;陳昌盛;鄭建永;吳石金
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P41/00;C12P17/04;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明提供了一種立體選擇性重組酯酶、編碼基因、載體、工程菌及其拆分(R,S)?吲哚啉?2?甲酸乙酯的應用；利用重組大腸桿菌或重組酯酶為生物催化劑同時催化拆分(R,S)?吲哚啉?2?甲酸乙酯，生成(S)?吲哚啉?2?甲酸，轉化率達45％左右，產物光學純度都在96％以上。

(一)技術領域

本發明涉及一種立體選擇性酯酶及其編碼基因，含有該編碼基因的載體、工程菌及其應用。

(二)背景技術

(S)-吲哚啉-2-甲酸及其某些化合物是目前實驗及臨床階段的許多新藥中間體。如法國Servier公司發明的心血管治療藥培哚普利，用于治療原發性高血壓與心力衰竭，作用時間長，副作用小，耐受性好，市場前景良好。這些具有心血管疾病治療功效的活性組中，普遍含有(S)-吲哚啉-2-甲酸或其加氫產物的特征結構。

目前，文獻報道的合成(S)-吲哚啉-2-甲酸主要是用具有旋光性的起始原料合成、手性助劑合成法、化學試劑拆分法。如浙江大學的錢超以L-苯丙氨酸為“手性源”，經硝化、溴化、分子內環合制備得到了6-硝基-(S)-吲哚啉-2-甲酸，該產物可通過硝基還原、重氮化和去重氮基反應制備得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。其路線如下：

Vincent等以吲哚-2-甲酸為原料，經酯化、錫/氯化氫還原得外消旋吲哚啉-2-甲酸乙酯，再用(R)-α-苯乙胺為拆分試劑對其進行拆分，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。化學合成或拆分法均存在步驟繁多，污染嚴重或者拆分試劑價格昂貴的缺點。采用酶法制備是趨勢，具有成本低，低排放的優勢。

De Vries等的專利報道了以鄰鹵(氯或溴)苯甲醛為原料，與醋酐縮合，所得的肉桂酸衍生物用苯丙氨酸氨解酶(從Rhodosporidium toruloides ATCC 10788中獲得)氨解得到光學純的鄰鹵-L-苯丙氨酸，然后再經環合反應得到光學純的(S)-吲哚啉-2-甲酸。

韓國SK公司專利報道使用外消旋的吲哚啉-2-甲酸甲酯作為底物，以商品化的Savinase作為催化劑水解，特異性水解(R)-吲哚啉-2-甲酸甲酯，再將不水解的(S)-吲哚啉-2-甲酸甲酯進一步水解，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸e.e.值達99％，收率47％。

對于拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯這種一步反應來說，酶法催化更具優勢，既可以徹底避免副反應的問題，也可以克服細胞膜阻礙底物和產物跨膜傳遞的問題。因而，通過基因工程技術高產酯酶，將為其在生物法拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的應用奠定良好的基礎。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種立體選擇性酯酶、編碼基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉化得到的重組基因工程菌，及其在生物法拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的應用，解決了用野生菌B8W22制備(S)-吲哚啉-2-甲酸過程中的ee.值達不到93％以上的技術難題。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種立體選擇性重組酯酶，所述重組酯酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

MET Pro Leu Asp Pro His Ile Gln Ile Phe Leu Asn Gln Tyr Asn Glu METPro Arg Pro Ser Leu Glu Asp Val Thr Pro Pro Gln Leu Arg Glu MET Glu Lys METSer Leu Thr Pro