[發明專利]一種三聯高效氨氮降解微生態制劑及其制備方法

在審

• 申請號: 201910765711.0
• 申請日: 2019-08-19
• 公開（公告）號: CN112391306A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 王凱;曹惠忠
• 申請（專利權）人: 南京師盛生態環境研究院有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C02F3/34;C02F3/02;C12R1/10;C12R1/01;C12R1/25
• 代理公司: 南京禾易知識產權代理有限公司 32320
• 代理人: 李海霞

1.一種三聯高效氨氮降解微生態制劑，由地衣芽孢桿菌、類球紅細菌和乳酸菌按比例混合而成，其特征在于：所述地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌的比例為1:1。

2.一種如權利要求1所述的三聯高效氨氮降解微生態制劑，其特征在于：所述類球紅細菌、地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌的比例為4:1:1，或3:1:1，或2:1:1，或1:1:1，或1:2:2，或1:3:3，或1:4:4中任意一種。

3.一種如權利要求1-2任意一項所述的三聯高效氨氮降解微生態制劑的制備方法，其特征在于：包括以下制備步驟：

步驟一：稱取好氧曝氣池淤泥樣品1g，于100ml無菌PBS緩沖液中搖勻，90℃水浴10min，取0.1ml涂布于錳鹽營養瓊脂平板上，于28℃培養48h，取菌落大的細菌進行純化再培養，芽孢染色和革蘭氏染色后，、拮抗指示菌用營養肉湯培養18h后，取0.1ml涂布于營養肉湯瓊脂平板，用內徑為8mm的打孔器在平板打1孔，取0.1ml芽孢桿菌培養菌液注入孔內，28℃恒溫箱內培養24h后，轉移至地衣芽孢桿菌液體培養基；

步驟二：取河底污泥樣品8g，加入100ml的滅菌海水，置于300ml的無菌三角瓶中，充分震蕩15min，去除雜草、巖石等大顆粒物質，制備成樣品懸濁液；

步驟三：取樣品懸濁液5mL，加入含有50mL的無菌富集培養基的150ml三角瓶中，封口膜封口，28℃，2000lux光照培養15d，得到富集培養液；

步驟四：取2ml富集培養液，加入100ml的液體分離培養基，于28℃，2000lux光照，300rpm振蕩培養3d，取100ul該培養液涂布在固體分離培養基上，28℃，2000lux光照，重復固體分離培養基上劃線分離，直至得到菌落形態一致，將菌落轉移至類球紅細菌液體培養基；

步驟五：取河底污泥樣品8g，進行10倍梯度法稀釋，選取10^-3、10^-4、10^-5和10^-6 4個稀釋度，向平板中加入0.1mL稀釋液，再傾入冷卻至50-60℃的含有2％碳酸鈣的MRS瓊脂培養基，混勻，37℃，培養36～48h后，挑取有較大溶鈣圈的單菌落，進行10倍梯度稀釋法純化培養3～4次，挑選乳白色的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，選取實驗結果為革蘭氏陽性的菌株，轉移至植物乳桿菌液體培養基；

步驟六：用接種環挑取類球紅細菌和枯草芽孢桿菌菌株分別接種到類球紅細菌液體培養基、地衣芽孢桿菌液體培養基和植物乳桿菌液體培養基中，于30℃、120rpm、搖床培養18-20h后，得到活化的類球紅細菌、地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌；

步驟七：將活化的類球紅細菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌按不同的比例混合，制得三聯高效氨氮降解微生態制劑。

4.如權利要求3所述的三聯高效氨氮降解微生態制劑的制備方法，其特征在于：步驟一中，所述好氧曝氣池淤泥樣品取自南京市勝科水務有限公司好氧曝氣池。

5.如權利要求3所述的三聯高效氨氮降解微生態制劑的制備方法，其特征在于：步驟一中，所述地衣芽孢桿菌液體培養基的配方為氯化鈉10g/l，蛋白胨10g/l，酵母提取物1g/l，純化水1L。

6.如權利要求3所述的三聯高效氨氮降解微生態制劑的制備方法，其特征在于：步驟二和五中，所述河底污泥樣品取自南京市城市景觀河河底淤泥。

7.如權利要求3所述的三聯高效氨氮降解微生態制劑的制備方法，其特征在于：步驟三中，所述無菌富集培養基的配方為KH₂PO₄ 0.1g/L，酵母提取物1.5g/L，蛋白胨0.05g，CaCl₂0.05g，NaAc 1.0g/L，NH₄Cl 0.2g/L，MnSO₄ 0.05g，MgSO₄ 0.025g，FeSO₄ 0.002g，用蒸餾水定容至1000mL。