[發(fā)明專利]用于櫻桃物種鑒定的特異性DNA區(qū)段和引物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910760640.5
• 申請(qǐng)日: 2019-08-16
• 公開（公告）號(hào): CN110408683B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 檀建新;桑亞新;賈欣月;王永;蘭青闊;劉雙;劉紫薇;沈曉玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京成實(shí)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11724
• 代理人: 葉立濤

本發(fā)明公開了一種用于櫻桃物種鑒定的特異性DNA區(qū)段、引物和探針。所述DNA區(qū)段的基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述PCR引物為C36?F、C36?R，所述熒光定量PCR和數(shù)字PCR引物和探針為C36?QF、C36?QR、C36?QP，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本發(fā)明利用了定性PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)以及數(shù)字PCR技術(shù)，建立一套櫻桃物種特異性定性及定量的檢測(cè)方法，并對(duì)櫻桃純果汁及含櫻桃等多種不同水果混合果汁，建立了較為精準(zhǔn)的櫻桃物種定性和定量的檢測(cè)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)物種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于櫻桃物種鑒定的特異性DNA區(qū)段和引物。

背景技術(shù)

2017年10月Shirasawa,Kenta等人應(yīng)用下一代測(cè)序技術(shù)，確定了甜櫻桃(Prunusavium)的基因組序列。組裝序列總長(zhǎng)度為272.4Mb，其中支架序列10148個(gè)，N50長(zhǎng)度為219.6kb。此項(xiàng)成果已發(fā)表在《DNA RESEARCH》上發(fā)表。

櫻桃作為“早春第一果”、“百果第一枝”具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，而國(guó)內(nèi)外還沒有關(guān)于櫻桃物種源性成分的研究，所以建立櫻桃物種特異性的檢測(cè)方法有利于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的完善。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在解決上述問題，提供用于櫻桃物種鑒定的特異性DNA區(qū)段和引物及探針。

用于櫻桃物種鑒定的特異性DNA區(qū)段，所述DNA區(qū)段的基因序列如序列表SEQ IDNO：1所示。

用于櫻桃物種特異性鑒定的PCR引物，所述引物為C36-F、C36-R，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

用于櫻桃物種鑒定的熒光定量PCR和數(shù)字PCR的引物和探針，所述引物為C36-QF、C36-QR，探針為C36-QP，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

一種定性鑒定櫻桃物種的試劑盒，包含上述引物C36-F、C36-R。

一種定量鑒定櫻桃物種的試劑盒，包含上述引物C36-QF、C36-QR和探針C36-QP。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明利用Perl語言編程和NCBI-BLAST從多種水果基因組中篩選獲得了1條櫻桃物種特異性序列，利用普通PCR通用體系和程序驗(yàn)證并測(cè)序，得到了完整的序列。建立了櫻桃物種特異性定性PCR鑒定方法，C36-F/R在引物濃度為0.4μmol/L、退火溫度為58℃時(shí)靈敏度可達(dá)0.5％。此方法可用于混合鮮榨果汁中櫻桃成分定性鑒定。建立了櫻桃物種特異性實(shí)時(shí)熒光PCR方法，C36-QF/QR/QP在引物濃度和探針濃度均為0.5μmol/L時(shí)，靈敏度達(dá)0.1％。擴(kuò)增條件經(jīng)優(yōu)化后，建立了Ct值與櫻桃DNA的質(zhì)量之間的量化關(guān)系方程式y(tǒng)＝-3.356x+31.062，R²＝0.998，擴(kuò)增效率為98.545％。此方法可用于定量鑒別混合鮮榨果汁、非濃縮果汁中櫻桃成分鑒定，并得能得到櫻桃模板DNA含量。建立了櫻桃物種特異性數(shù)字PCR方法，C36-QF/QR/QP在引物濃度為0.5μmol/L，探針濃度為0.2μmol/L，退火溫度為56.7℃時(shí)擴(kuò)增效果最佳。確定線性定量范圍下限為0.24ng，拷貝數(shù)和DNA模板量之間具有y＝7.4093x+1.2482的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)R²＝1，檢測(cè)拷貝數(shù)下限約為1.8copy/μL。此方法可用于定量鑒別混合鮮榨果汁、非濃縮果汁和濃縮果汁中櫻桃成分鑒定，并能得到櫻桃的目標(biāo)DNA的拷貝數(shù)。

附圖說明

圖1為引物tRNALeu-F/R對(duì)水果DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；