[發明專利]一株產正丁酸的大腸桿菌工程菌的構建及應用

有效

• 申請號: 201910738599.1
• 申請日: 2019-08-12
• 公開（公告）號: CN110438056B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 陳修來;郭亮;劉立明;刁文文;劉佳;羅秋玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/52;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明公開了一株產正丁酸的大腸桿菌工程菌的構建及應用，屬于發酵工程技術領域。本發明以Escherichia coli ATCC 8739為出發菌株，利用代謝工程手段，通過構建丁酸的合成路徑以及切斷冗余代謝支路構建了生產丁酸的大腸桿菌基因工程菌。在發酵72h后丁酸的產量達到15g/L。該發酵過程為好氧發酵，菌體生長快，發酵周期短，產酸速率高，目前未見直接利用甘油發酵生產丁酸的報道。該方法采用的發酵工藝簡單，易于控制，生產成本低，有利于工業化生產的推廣和應用。

技術領域

本發明涉及一株產丁酸的大腸桿菌工程菌的構建及應用，屬于發酵工程技術領域。

背景技術

丁酸(Butyric acid)是一種短鏈脂肪酸，是合成其他香料物質和精細化工產品的重要原料。丁酸及其衍生物被廣泛應用于化工、食品、醫藥、動物飼料和化妝品等行業。丁酸衍生物，如丁酸酯，用于飲料、食品和化妝品中作為芳香和增味劑。由丁酸和醋酸纖維素制備的聚合物可用于制造塑料和紡織纖維。丁酸鹽的衍生物作為高活性化合物，顯示出具有抗癌作用。此外，丁酸的商業價值因其作為生物燃料(如正丁醇)的前體而備受推崇。

目前，丁酸的生產方法主要有化學法和發酵法?；瘜W法是采用源于石油化工的正丁醛氧化法。與化學法相比，生物發酵法具有原料廣泛、環境友好和可持續等優點，發酵法主要以淀粉或糖為原料，用丁酸梭狀芽孢桿菌發酵得丁酸。

丁酸梭狀芽孢桿菌是嚴格厭氧的革蘭氏陽性菌，長期以來一直被研究用于生產丁酸。然而，丁酸梭狀芽孢桿菌發酵過程復雜，發酵條件難以控制，操作步驟繁瑣，需要仔細優化影響丁酸產量的關鍵因素。此外，可用于丁酸梭狀芽孢桿菌的遺傳操作工具和其生理信息少也阻礙了其發展。而大腸桿菌由于其生長過程已于控制，遺傳操作工具成熟，遺傳背景清晰。但目前應用大腸桿菌生產丁酸，是以葡萄糖和乙酸為底物，發酵48h，產量為10g/L左右(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(19):4342-4348)。

甘油(glycerol)學名丙三醇，是一種三元醇。隨著化石燃料日趨緊張，國際油價持續上漲，人們環保意識隨之增強且越來越注重研究開發可再生的替代能源，生物柴油是一個有希望替代的可再生燃料，其生產的原料主要包括動植物的油脂和餐飲方面的垃圾油，在水解制備生物柴油的同時，將會生成一定量的甘油。近年來，生物柴油的發展速度加快，副產物甘油的產量也在迅速上升，這將使得甘油的價格大幅下降。此外，工業化制皂的過程中，閉合的皂膠經鹽析后，下層溶液中也含有副產物甘油。如此大量的甘油生成將會給生物柴油行業帶來嚴重負擔，增加生產成本。相比于高額的處理成本，如果能夠高效充分利用這些甘油轉化成需要的高附加值化合物將帶來巨大的效益，降低生物柴油制造的成本，減少資源的浪費、污染物排放以及環境污染等。若能采用微生物發酵直接利用甘油生產丁酸，則可以解決上述問題和不足。

丙酮酸是合成丁酸的前體物質，獲得能夠積累丙酮酸的菌株是發酵法生產丁酸的必要前提。

綜上所述，提供一種以甘油為底物發酵生產正丁酸的低污染、低成本的方法，對于正丁酸的工業生產具有重要的應用價值。然而，目前該方法還未見報道。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種基因工程菌，是對出發菌株大腸桿菌(Escherichia coli)進行基因工程改造獲得的菌；所述基因工程改造為不表達乙酸激酶基因(ackA)、乙醇脫氫酶基因(adhE)和乳酸脫氫酶基因(ldhA)，并游離過表達乙酰乙酰輔酶A硫解酶基因(atoB)、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶基因(hbd)、3-羥基丁酰輔酶A脫水酶基因(crt)、反式烯酰輔酶A還原酶基因(ter)和?；o酶A硫酯酶II基因(tesB)。所述不表達包括敲除或沉默。

在本發明的一種實施方式中，所述出發菌株包括大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 8739。所述Escherichia coli ATCC 8739是在ATCC上購買的野生型大腸桿菌。