[發明專利]人體液中抗LGI1自身抗體的檢測材料、制備方法及應用

在審

• 申請號: 201910738530.9
• 申請日: 2019-08-12
• 公開（公告）號: CN110606882A
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發明（設計）人: 閆亞平;李怡婷;李科
• 申請（專利權）人: 陜西脈元生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/14;C12N15/867;G01N33/531;G01N33/564
• 代理公司: 61216 西安恒泰知識產權代理事務所
• 代理人: 李婷;金艷婷

1.人體液中抗LGI1自身抗體的檢測材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，獲取LGI1的CDS序列及其信號肽序列作為目的基因，將帶有酶切位點的兩個目的基因分別插入17T2A質粒載體中，得到重組質粒載體17T2A-LGI1；

其中，17T2A質粒載體包括含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列、原核復制子pUC Ori序列、病毒復制子SV4 0O ri序列、RSV啟動子、慢病毒5’LTR、慢病毒3’LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件、eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件、CMV啟動子、MCS多克隆位點以及T2A元件；

步驟2，將重組質粒載體17T2A-LGI1轉染入293T細胞中，得到17T2A-LGI1-293T細胞；

步驟3，裂解17T2A-LGI1-293T細胞，提取其胞漿蛋白，使用PEG沉淀法提取胞漿蛋白中的LGI1抗原；

步驟4，將步驟3提取得到的LGI1抗原固化在載體膜上，得到人體液中抗LGI1自身抗體的檢測材料。

2.如權利要求1所述的人體液中抗LGI1自身抗體的檢測材料的制備方法，其特征在于，所述的步驟1具體包括以下步驟：

步驟1.1：通過人工合成或者PCR方法獲得LGI1的CDS序列及其信號肽序列作為目的基因，在兩個目的基因兩端均加設SalI/NotI的酶切位點；

步驟1.2：將帶有酶切位點的兩個目的基因插入17T2A質粒載體中，插入位點為SalI/NotI，得到重組質粒，將該重組質粒命名為17T2A-LGI1；

步驟1.3：對重組質粒17T2A-LGI1進行測序，將測序正確的帶有目的基因的菌種擴大培養后進行質粒提取，得到重組質粒載體17T2A-LGI1。

3.如權利要求1所述的人體液中抗LGI1自身抗體的檢測材料的制備方法，其特征在于，所述的步驟2中使用PEI轉染方法、lipofectamin2000、lipofectamin3000、lipA或電轉法將17T2A-LGI1轉染入293T細胞中，其中，電轉條件為1500V～2000V、25μF、200Ω。

4.如權利要求1所述的人體液中抗LGI1自身抗體的檢測材料的制備方法，其特征在于，所述的載體膜為硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜、具有蛋白吸附能力的玻片、塑料材質的細胞培養皿或培養板。

5.權利要求1至4任一項所述的制備方法制備的人體液中抗LGI1自身抗體的檢測材料，其特征在于，該檢測材料包括載體膜和固化在載體膜上的從17T2A-LGI1-293T細胞提取的膜蛋白-細胞膜復合物。

6.將權利要求1至5任一項所述的人體液中抗LGI1自身抗體的檢測材料用于檢測樣品中的LGI1抗體。

7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，檢測樣品中的LGI1抗體的檢測過程具體包括：將待檢測樣品和封閉材料混合后孵育，孵育后加入到權利要求1至6任一項所述的抗LGI1自身抗體的檢測材料中再次孵育，洗滌，加入AP標記羊抗人IgG二抗孵育后進行底物顯色；

其中，封閉材料包括經過處理的載體膜和固化在處理后載體膜上的17T2A-293T細胞蛋白；所述的載體膜的處理過程為：將載體膜加入蔗糖與葡萄糖按照體積摩爾濃度比為1:1比例混合的混合試劑中，在100℃烘干20-30min或者37℃烘干8～16h。