[發(fā)明專利]人體液中抗NMDAR自身抗體的檢測材料、制備方法及應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910738488.0 | 申請日： | 2019-08-12 |
| 公開（公告）號： | CN110606887A | 公開（公告）日： | 2019-12-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 閆亞平;李怡婷;郝文斌;李科 | 申請（專利權(quán)）人： | 陜西脈元生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C07K14/705 | 分類號： | C07K14/705;C07K1/14;C12N15/861;G01N33/531;G01N33/564 |
| 代理公司： | 61216 西安恒泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 | 代理人： | 李婷;金艷婷 |
| 地址： | 710003 陜西省西安*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 堿性磷酸酶底物 封閉材料 檢測材料 檢測樣品 抗原包被 抗原結(jié)合 快速檢測 受體檢測 顯色反應(yīng) 自身抗體 腦炎 靈敏度 腦脊液 人體液 人血清 載體膜 抗體 可用 配體 顯色 制備 診斷 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明公開了人體液中抗NMDAR自身抗體的檢測材料、制備方法及應(yīng)用，本發(fā)明將NMDAR抗原包被于載體膜上制成抗NMDAR受體檢測材料，人血清和腦脊液中的特異性NMDAR抗體會與抗原結(jié)合，利用堿性磷酸酶底物?配體反應(yīng)進(jìn)行顯色，并在顯色反應(yīng)中加入本發(fā)明的封閉材料，可用通過肉眼觀察直接判斷檢測樣品中是否含有NMDAR抗體。該方法具有靈敏度高，操作簡便，快速檢測等優(yōu)點(diǎn)，有助于抗NMDAR受體腦炎的識別和診斷。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人體液中抗NMDAR自身抗體的檢測材料、制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)
抗N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)邊緣性腦炎(以下簡稱抗NMDAR腦炎)屬于自身免疫性疾病，世界首例病例于2007年由RobertaVitaliani等人發(fā)現(xiàn)，同年Josep Dalmau等人在該類病人的血清和腦脊液中檢測到了抗NMDAR抗體，并將此作為診斷該類疾病的主要依據(jù)。
目前針對抗NMDAR腦炎的診斷手段包括詢問病史、一般內(nèi)科體征檢查、X線與超聲、神經(jīng)影像學(xué)、血液檢查和腦脊液檢查等，其中以血液和腦脊液中NMDAR特異性抗體陽性為確診的主要依據(jù)。90％以上的抗NMDAR腦炎患者體內(nèi)可檢測出靶向NMDAR亞基的IgG抗體。血液檢查和腦脊液檢查的具體方法包括免疫熒光、ELISA、免疫印跡、免疫組織化學(xué)等等，使用這些方法在臨床檢測上的累積靈敏度估計(jì)為60％-80％。Nuria Gresa-Arribas等人以250病例為研究對象，使用免疫組織化學(xué)和NMDAR過表達(dá)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來檢測上述病人的血清樣本，2種方法的檢出率分別為91.6％和86.8％。Andrew McKeo等人采取免疫熒光法對467個病人的樣本(包括血液和腦脊液)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示有約12％的陽性樣本未被檢出。
因此，目前常用的檢測手段，如免疫熒光、ELISA、免疫印跡、免疫組化等，都有檢測過程耗時較長，步驟繁瑣，抗體需求量大，成本高，靈敏度不高等缺點(diǎn)，利用這些方法很難一次性對大批量樣本同時檢測或針對某一個樣本進(jìn)行反復(fù)檢測。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種對NMDAR自身抗體進(jìn)行檢測的檢測材料以及該材料的制備方法及應(yīng)用，解決現(xiàn)有的檢測方法檢測耗時長、步驟繁瑣、抗體需求量大、成本高、靈敏度低等問題。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
人體液中抗NMDAR自身抗體的檢測材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟1，獲取NMDAR的CDS序列作為目的基因，將帶有酶切位點(diǎn)的目的基因插入pShuttle-cmv質(zhì)粒載體中，得到重組質(zhì)粒載體pAdEasy-NMDAR1α；
步驟2：將重組質(zhì)粒載體pAdEasy-NMDAR1α轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，得到腺病毒pAdEasy-NMDAR1α-293T細(xì)胞；
步驟3：裂解pAdEasy-NMDAR1α-293T細(xì)胞，去除pAdEasy-NMDAR1α-293T細(xì)胞的核蛋白、DNA和胞漿蛋白，再加入復(fù)合提取液，4℃靜置15～30min后在35～40℃水浴，直至出現(xiàn)分層；
其中，復(fù)合提取液為Triton X100、CHAPS、N-甲基葡糖胺按照體積比為1:1:1的比例混合或洋地黃皂苷、Triton X100、NP40、CHAPS按照體積比1:1～2：1～2：1的比例混合；
步驟4：取分層后的沉淀，向沉淀中加入溶劑混勻，去除上清液，將所得沉淀固化在載體膜上，得到人體液中抗NMDAR自身抗體的檢測材料；
其中，溶劑為10％PEG的無水乙醇溶液、10％PEG的丙酮溶液或10％PEG的異丙酮溶液。
具體的，所述的步驟1具體包括以下步驟：
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