[發明專利]一種高產β-法尼烯突變菌株的復合誘變育種方法

在審

• 申請號: 201910738357.2
• 申請日: 2019-08-12
• 公開（公告）號: CN110408609A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 寇鳳雨;王一然;劉偉;馬杰希
• 申請（專利權）人: 山東泓達生物科技有限公司
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N15/01;C12N1/02;C12N1/20;C12R1/19
• 代理公司: 青島高曉專利事務所(普通合伙) 37104
• 代理人: 吳冬群

本發明涉及生物誘變育種技術領域，尤其是一種高產β?法尼烯突變菌株的復合誘變育種方法。該方法步驟包括：菌懸液的制備、等離子體?紫外線復合誘變、平板初篩、搖瓶復篩和發酵罐驗證。本發明的種高產β?法尼烯突變菌株的復合誘變育種方法，通過等離子體?紫外復合誘變后，再采用平板初篩和搖瓶復篩，最終選育出了的β?法尼烯高產突變菌株在發酵罐中β?法尼烯的發酵單位比出發菌株提高了169.10％，并且通過8次連續傳代仍具有良好的遺傳穩定性。

技術領域

本發明涉及生物誘變育種技術領域，尤其是一種高產β-法尼烯突變菌株的復合誘變育種方法。

背景技術

β-法尼烯(β-Farnesene，又稱β-金合歡烯)是一種由三個異戊二烯組成的鏈狀倍半萜烯化合物，在日化、農業、化工、能源和醫藥等領域有著廣泛應用。尤其在醫藥領域，β-法尼烯是合成維生素E的前體物質異植物醇的重要原料。維生素E是全球市場容量最大的維生素類產品之一，每年全球約生產6萬噸，維生素E前體異植物醇的原料供應一直被德國巴斯夫和荷蘭帝斯曼所壟斷，他們以檸檬醛作為中間體合成異植物醇，進而采用全化學合成工藝將三甲基氫醌和異植物醇進行環合反應生成維生素E。但全化學合成技術具有污染大，成本高的問題，人們一直試圖尋找一種更節能環保的方法來生產維生素E，而采用微生物法合成β-法尼烯，能夠使得維生素E的生產過程具有高轉化率、低成本、低能耗等優勢，在很大程度上降低了維生素E的生產成本具有，并且生產過程也更加綠色環保，可減少碳排放60％，因此高產β-法尼烯菌種的選育是企業降低發酵成本、提高產品市場競爭力的有效手段之一。

傳統菌種選育方法有化學誘變劑(烷化劑、堿基類似物及亞硝酸等)和物理誘變(紫外線、X射線及快中子等)。其中，紫外誘變是最常用的人工誘變方法之一，其光譜范圍在40-390nm。DNA對紫外線有強烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，當其吸收紫外光后形成嘧啶二聚體，從而阻礙堿基間的正常配對和DNA的復制，最終導致微生物的突變或死亡。然而，長期重復使用傳統的誘變手段，往往導致突變效率低、突變譜窄和抗性飽和等難題。而常壓室溫等離子體(ARTP)誘變技術是近年發展起來的新誘變技術，具有操作便捷、突變率高、安全性好等優點，廣泛應用于工業微生物誘變育種領域。此方法以氦氣為工作氣體的離子體源中富含多種活性能量粒子，這些活性粒子能夠對微生物的遺傳物質造成損傷，并誘發生物細胞啟動SOS修復機制。SOS修復過程為一種高容錯率修復，因此修復過程中會產生種類豐富的錯配位點，并最終穩定遺傳進而形成突變株。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高產β-法尼烯突變菌株的復合誘變育種方法，克服前述現有技術的不足，以產β-法尼烯的大腸桿菌EC-16為出發菌株，通過采用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變和紫外線誘變的復合誘變技術，并利用β-法尼烯代謝合成途徑中的前體物質異戊烯焦磷酸(IPP)作為篩選壓力進一步提高突變株正突變率，進行組合誘變篩選，最終獲得遺傳性狀穩定的β-法尼烯高產突變株。

本發明解決其技術問題所采取的技術方案是：

一種高產β-法尼烯突變菌株的復合誘變育種方法，包括如下步驟：

(1)菌懸液的制備：選取恒溫培養箱內37℃下培養2天的EC-16斜面菌苔，用10mL無菌生理鹽水將菌苔洗下，放入盛有玻璃珠的無菌錐形瓶中，無菌錐形瓶置于震蕩裝置中，在30℃、220-300r/min的條件下震蕩5-15min，使菌體分散，菌體分散后于2500-5000r/min條件下離心10-20min，棄上清液，將菌體用生理鹽水懸浮并洗滌2-3次，采用細菌計數板計數，調整菌懸液濃度約為10⁶-10⁹個/mL，備用；