[發明專利]一種通過基因敲除技術增加斑馬魚生長速度的方法

有效

• 申請號: 201910736732.X
• 申請日: 2019-08-10
• 公開（公告）號: CN111269943B
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發明（設計）人: 張運生;劉良國;楊品紅
• 申請（專利權）人: 湖南文理學院
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發明屬于基因工程技術領域，公開了一種通過基因敲除技術增加斑馬魚生長速度的方法，所述通過基因敲除技術增加斑馬魚生長速度的方法包括以下步驟：通過NCBI在線數據庫查找斑馬魚actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因組序列；設計actRIIB基因和alk4基因敲除靶位點；體外轉錄獲得Cas9mRNA；Cas9mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA顯微共注射；F1代雜合突變個體的篩選及突變類型確定；F2代純合突變個體的獲得，待F1代雜合突變個體性成熟后，F1代個體自交獲得F2代；根據孟德爾定律，從F2中篩選出純合突變個體。本發明發現，共敲除斑馬魚actRIIB和alk4會導致斑馬魚快速生長。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種通過基因敲除技術增加斑馬魚生長速度的方法。

背景技術

目前，最接近的現有技術：

提高魚類生長率，即可以縮短上市時間，提高單位時間內的養殖產量，又可以一定程度上降低魚類發病率，從而降低養殖風險。魚類生長速度快慢直接關系到其養殖推廣和養殖效益，因此如何增加魚類生長速度，一直是魚類相關研究的重點和熱點。目前快長轉基因魚研制技術多為基因的過表達技術，且所選用的靶基因均為生長激素基因，例如朱作言院士團隊研制的轉基因黃河鯉以及目前在美國批準上市的轉基因三文魚。但是在有些魚類中，過表達生長激素基因，對魚類生長并沒有明顯的促進作用，如在已馴化的虹鱒魚中過表達鮭魚生長激素基因，并未導致其生長速度加快，因此該方法應用范圍有一定的局限性，而且過表達基因產生的轉基因魚，可能具有一定的環境危害，推廣養殖難度很大。利用基因編輯技術CRISPR/Cas9沉默基因表達獲得快長魚類品系是近幾年研究的熱點，該技術同樣需要靶基因的尋找和篩選，目前研究最多的靶基因為生長抑制素基因，但是在一些魚類中敲除該基因，并不能得到快長的魚類品系，應用范圍仍具有一定的局限性。發現共敲除actRIIB和alk4基因，可以獲得生長速度顯著加快的斑馬魚，該技術有望推廣到經濟魚類，一定程度上增加魚類養殖經濟效益。

肌肉生長抑制素(myostatin，mstn)又稱生長分化因子8(growth anddifferentiation factor-8,gdf-8)，在多種生物肌肉生長中起負向調節作用。例如在牛、小鼠、狗和人中，該基因功能的全部或部分喪失均會導致肌肉量的顯著增加。根據序列的分析比較及同源性分析，抑肌素被歸為轉化生長因子超級家族(Transforming growthfactor superfamily,TGF)的一員,作為一種細胞因子信號蛋白，其特異的傳遞信號的主要受體是激活素II型B受體(Activin type IIB receiptor,actRIIB)，再與特異性較弱的另一共同受體activin-like kinase 4(alk4)結合，通過它們將信號傳導至胞內的信號途徑。

抑肌素對肌肉生長的負調控作用是通過激活素受體來實現其正常的信號傳導的，在骨胳肌特異性表達顯著抑制型的激活素受體actRIIB的轉基因小鼠中，表達失去了其信號傳導的蛋白質基團的顯著抑制型的激活素受體大量地與抑肌素在體內結合，阻止了激活素受體傳導抑肌素信號的通路，使這類轉基因小鼠也表現出肌肉組織的異常增生?？梢?，目前針對actRIIB和alk4的研究多集中在小鼠等模式生物中，且均為基礎理論研究，目前還未有應用。在魚類中，actRIIB和alk4的研究甚少，尚處于起步階段，目前研究發現共敲除actRIIB和alk4基因，可以獲得快長的斑馬魚品系，并有望推廣至經濟魚類，促進漁業發展。

綜上所述，現有技術存在的問題是：目前在魚類中對actRIIB和alk4的研究尚處于起步階段。

解決上述技術問題的難度：

1利用CRIPR/Cas9技術同時敲除兩個基因的效率比較低，需要篩選大量F1代個體。

2需要傳代3次，才能獲得純合的個體，且F2中純合個體占比僅為6.25％，篩選工作量較大。

解決上述技術問題的意義：