[發明專利]DNA二代測序文庫及其構建方法、構建試劑盒

在審

• 申請號: 201910735767.1
• 申請日: 2019-08-09
• 公開（公告）號: CN110484532A
• 公開（公告）日: 2019-11-22
• 發明（設計）人: 劉楊楊;李瑞強;李雷;姚文鈞;宋迎楠;成崗
• 申請（專利權）人: 北京諾禾致源科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 11240 北京康信知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 梁文惠<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明公開了一種DNA二代測序文庫及其構建方法、構建試劑盒。其中，該構建方法包括以下步驟：將DNA樣本通過酶切的方法獲得片段化的原始模版DNA，然后無需純化酶切反應液，直接將酶切產物進行基于單鏈接頭連接的方法構建DNA二代測序文庫。應用本發明的技術方案，基于酶切進行片段化并聯用單鏈建庫的方法來構建FFPE樣本NGS測序文庫，簡單闡述為：使用酶切的方法對FFPE DNA進行片段化，之后無需對反應產物進行純化，直接利用單鏈建庫方法構建測序文庫，該方法能夠對低起始量、樣本降解嚴重的FFPE樣本進行建庫，提高建庫成功率以及原始模版檢出數量。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種DNA二代測序文庫及其構建方法、構建試劑盒。

背景技術

FFPE(formalin-fixed paraffin embedded，福爾馬林固定和石蠟包埋)樣本存在樣本量低，樣本中DNA降解嚴重等特點，這些特點使得FFPE樣本極易建庫失敗。在常規的雙鏈建庫中，損傷的DNA在接頭連接后進行PCR擴增的過程中會丟失，從而使得大量模版丟失。而單鏈建庫首先將雙鏈DNA進行變性形成單鏈，在這個過程中損傷DNA也可以形成片段化的單鏈DNA，然后進行單鏈接頭的連接，進而最大程度的減少原始模版的損失。

目前的文庫構建，由于測序儀器的讀長限制，需要文庫的插入片段長度有一定的限制，這就要求對原始模版進行片段化。目前片段化的方法主要有兩種：一種是利用超聲打斷的方式獲得片段化的DNA，一種是利用酶切的方法對DNA進行切割。這兩種方法都是對DNA進行處理，處理后都需要進行純化。而任何純化/操作都將損失部分原始DNA。

KAPA公司有一款基于酶切的方法進行文庫構建的試劑盒，該試劑盒可以對DNA進行酶切，并無需對酶切產物進行純化，之后直接進行雙鏈建庫。該方法在一定程度上減少原始模版片段化的損失，但是無法避免損傷的DNA分子在建庫中的丟失。

目前常用的測序文庫構建方法均是雙鏈建庫。另外基于插入片段的打斷方法，原始模版在片段化后都需要進行純化以獲得所需的目的片段大小的DNA，這一過程會損失一定量的DNA，對于FFPE樣本，DNA模版損失越多，建庫失敗概率越大。

發明內容

本發明旨在提供一種DNA二代測序文庫及其構建方法、構建試劑盒，以解決現有技術中降解嚴重FFPE樣本建庫極易因DNA數量低而失敗的技術問題。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種DNA二代測序文庫的構建方法。該構建方法包括以下步驟：將DNA樣本通過酶切的方法獲得片段化的原始模版DNA，然后無需純化酶切反應液，直接將酶切產物進行基于單鏈接頭連接的方法構建DNA二代測序文庫。

進一步地，DNA樣本為FFPE樣本提取的DNA。

進一步地，基于單鏈接頭連接的方法構建DNA二代測序文庫為swift單鏈建庫方法。

進一步地，swift單鏈建庫方法包括模版變性、單鏈接頭連接、延伸及產物純化、二鏈接頭連接及產物純化和index PCR擴增及產物純化。

根據本發明的另一方面，提供了一種DNA二代測序文庫。該DNA二代測序文庫通過上述任一種DNA二代測序文庫的構建方法構建得到。

根據本發明的再一方面，提供了一種DNA二代測序文庫的構建試劑盒。該構建試劑盒包括酶切相關的試劑和基于單鏈接頭連接的方法構建DNA二代測序文庫的試劑。

應用本發明的技術方案，基于酶切進行片段化并聯用單鏈建庫的方法來構建FFPE樣本NGS測序文庫，簡單闡述為：使用酶切的方法對FFPE DNA進行片段化，之后無需對反應產物進行純化，直接利用單鏈建庫方法構建測序文庫，該方法能夠對低起始量、樣本降解嚴重的FFPE樣本進行建庫，提高建庫成功率以及原始模版檢出數量。

附圖說明