[發(fā)明專(zhuān)利]抗BCoV-N蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系及抗體和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910734259.1
• 申請(qǐng)日: 2019-08-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110452884B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周玉龍;任亞超;胡林杰;叢彥龍;孟野;翟海瑞;賈偉強(qiáng);武瑞;候喜林;朱戰(zhàn)波;李春龍;任德強(qiáng);李娜;高偉;李旭陽(yáng);靳廣杰;王夢(mèng)心
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/20;C07K16/10;A61K39/42;A61P31/14;C12R1/91
• 代理公司: 大慶禹奧專(zhuān)利事務(wù)所 23208
• 代理人: 朱士文;楊曉梅

本發(fā)明涉及一株抗BCoV?N蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合產(chǎn)生，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC No.17693。本發(fā)明還涉及上述抗BCoV?N蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體及其該單克隆抗體的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明制備的單克隆抗體在Western blot和IFA實(shí)驗(yàn)中均能與BCoV發(fā)生特異性反應(yīng)，而且特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單克隆抗體與BRV、BVDV、IBRV和BPIV3等牛源常見(jiàn)病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，說(shuō)明該單克隆抗體與活性BCoV病毒粒子具有較好的親和性，更進(jìn)一步證明這些抗體在制備BCoV抗原診斷試劑盒和基礎(chǔ)研究方面具有重要商業(yè)價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一株抗BCoV-N蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系及其抗體和應(yīng)用。

背景技術(shù)

牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCoV)屬于套式病毒目(Nidovirales)，冠狀毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)，是一個(gè)多形的、有囊膜、單股正鏈的RNA病毒。BCoV是引起牛呼吸道感染、新生犢牛腹瀉和成年牛冬痢的重要病源，從1972年起，BCoV已被多個(gè)國(guó)家有所報(bào)道，該病呈世界性分布，不僅影響奶牛產(chǎn)奶性能而且病愈后的犢牛生長(zhǎng)、發(fā)育和生產(chǎn)性能都會(huì)受到影響，BCoV主要由消化道和呼吸道兩種途徑傳播，感染的牛會(huì)在特定的時(shí)間排毒來(lái)感染牛群，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)有效的疫苗，因此，早期診斷對(duì)于防控該病具有重要意義。

BCoV粒子共有5種主要結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白N，囊膜蛋白M，纖突蛋白S，小膜蛋白E和血凝脂酶糖蛋白HE，含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域的核衣殼蛋白(N)是一種堿性磷蛋白，在冠狀病毒RNA合成中發(fā)揮作用，經(jīng)DNAStar軟件預(yù)測(cè)的N蛋白免疫原性較好的疏水區(qū)域，同時(shí)具有高度的保守性，獲得的重組蛋白為可溶性表達(dá)，采用鎳柱天然條件下純化得到的有活性蛋白，親和力較好，容易與抗體結(jié)合。但是，用大腸桿菌表達(dá)重組蛋白制備單克隆抗體最大的弊端就是容易出現(xiàn)抗原構(gòu)象改變，導(dǎo)致制備的單克隆抗體不能識(shí)別病毒粒子。

雜交瘤技術(shù)自20世紀(jì)70年代問(wèn)世以來(lái)，到今日已經(jīng)是很成熟的技術(shù)。從抗原的制備到雜交瘤細(xì)胞的凍存在能保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的前提下試驗(yàn)周期約為5個(gè)月。實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，是一門(mén)綜合性實(shí)驗(yàn)技術(shù)，涉及到小鼠免疫，細(xì)胞培養(yǎng)等步驟，受多種試驗(yàn)因素影響。綜上，將雜交瘤技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)抗BCoV-N蛋白單克隆抗體還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的是提供一種抗BCoV-N蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC No:17693。

本發(fā)明的第二目的是提供上述抗BCoV-N蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。

本發(fā)明的第三目的是提供上述單克隆抗體的制備方法。

本發(fā)明的第四目的是提供上述單克隆抗體的應(yīng)用。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一、一株抗BCoV-N蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合產(chǎn)生，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC No.17693。

二、上述的抗BCoV-N蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。

三、上述單克隆抗體的制備方法，該方法包括以下步驟：

(1)構(gòu)建好的pET-32a-BCoV-N重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生pET-32a-BCoV-N蛋白；

(2)pET-32a-BCoV-N蛋白為可溶性蛋白作為抗原免疫小鼠；

(3)獲取免疫小鼠的脾細(xì)胞，和SP2/0細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞；

(4)雜交瘤細(xì)胞注入小鼠，產(chǎn)生抗BCoV-N蛋白單克隆抗體。

四、上述單克隆抗體在抗牛冠狀病毒中的應(yīng)用。