[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)特定基因甲基化的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910729445.6
• 申請(qǐng)日: 2019-08-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110283891B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張亮;楊光
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津康博爾生物基因技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6858
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6858
• 代理公司: 天津市君硯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12239
• 代理人: 何德俊

本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)特定基因甲基化的檢測(cè)方法，包括甲基化特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)和側(cè)向流核酸檢測(cè)。基于PCR方法對(duì)特定基因甲基化進(jìn)行識(shí)別與擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記后，結(jié)合側(cè)向流技術(shù)，對(duì)甲基化進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果是，采用簡(jiǎn)單高效的DNA甲基化處理技術(shù)和PCR擴(kuò)增技術(shù)，利用納米彩色乳膠微球作為核酸檢測(cè)的可視化信號(hào)，代替熒光探針等光學(xué)信號(hào)，無(wú)需復(fù)雜的操作和昂貴的儀器，實(shí)現(xiàn)比同類(lèi)技術(shù)或產(chǎn)品更好的檢測(cè)靈敏性和特異性，實(shí)現(xiàn)快速、方便、靈敏、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)特定基因甲基化，適合推廣應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是一種檢測(cè)特定基因甲基化的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

惡性腫瘤(癌癥)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一，惡性腫瘤死亡約占我國(guó)居民全部死因的四分之一，且呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)。其中的一條原因是，在中國(guó)60％-80％的癌癥初次確診已是中晚期，患者五年生存率相對(duì)較低。因此，在早期對(duì)癌癥進(jìn)行篩查對(duì)癌癥的診斷和治療具有重要意義。目前，癌癥的常規(guī)篩查方法主要為腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)和影像學(xué)檢查，但這些方法或靈敏性不夠而導(dǎo)致漏檢，或特異性不足而導(dǎo)致誤診、或?qū)颊咴斐刹贿m或性?xún)r(jià)比低，從而導(dǎo)致患者的依從性差。

近年來(lái)，很多研究表明，某些基因的DNA甲基化與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。基因組中異常的DNA甲基化可能通過(guò)沉默多種腫瘤抑制基因而促成惡性轉(zhuǎn)化。這種表觀遺傳改變被認(rèn)為發(fā)生在腫瘤發(fā)展的早期，可能先于遺傳改變。比如，SEPT9基因甲基化已被認(rèn)為是結(jié)直腸癌早期的特異性生物標(biāo)志物。Epigenomics AG公司最早在2008年便報(bào)道了從游離DNA中檢測(cè)SEPT9甲基化作為結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物。隨后，該公司先后推出了第一代和第二代的Epi proColon實(shí)時(shí)PCR試劑盒，并獲得歐洲CE和美國(guó)FDA認(rèn)證。Epi proColon試劑盒基于熒光PCR方法，用于定性檢測(cè)來(lái)自患者血漿中SEPT9 DNA甲基化水平。但是，這類(lèi)方法需要較為昂貴的熒光PCR設(shè)備，而且操作過(guò)程較為繁瑣，工作流程執(zhí)行的測(cè)試周期大約需要8小時(shí)，對(duì)操作人員專(zhuān)業(yè)要求較高，因此并不能很好的滿足實(shí)際的篩查需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在一定程度上解決上述相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。因此，本發(fā)明的目的在于提出一種檢測(cè)特定基因甲基化的檢測(cè)方法，可用于體外定性檢測(cè)癌癥患者血清、血漿、糞便以及石蠟包埋病理組織中某種特定基因的甲基化，采用簡(jiǎn)單高效的DNA甲基化處理技術(shù)和PCR擴(kuò)增技術(shù)，利用納米彩色乳膠微球作為核酸檢測(cè)的可視化信號(hào)，代替熒光探針等光學(xué)信號(hào)，無(wú)需復(fù)雜的操作和昂貴的儀器，實(shí)現(xiàn)比同類(lèi)技術(shù)或產(chǎn)品更好的檢測(cè)靈敏性和特異性，實(shí)現(xiàn)快速、方便、靈敏、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)特定基因的甲基化，適合推廣應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種檢測(cè)特定基因甲基化的檢測(cè)方法，包括甲基化特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)和側(cè)向流核酸檢測(cè)；所述甲基化特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)的使用組分包括甲基化DNA處理組分、特定基因甲基化特異性引物組、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶、UNG酶和反應(yīng)緩沖液；所述側(cè)向流核酸檢測(cè)的檢測(cè)形式為側(cè)向流核酸檢測(cè)試紙，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜檢測(cè)區(qū)和吸水墊。

所述甲基化DNA處理組分為甲基化依賴(lài)性的限制內(nèi)切酶；所述甲基化依賴(lài)性的限制內(nèi)切酶為只能識(shí)別含有甲基化的DNA序列并進(jìn)行特異型切割。

優(yōu)選地，所述甲基化依賴(lài)性的限制內(nèi)切酶為MteI、LpnPI、BlsI、GlaI、PcsI、KroI中的一種或幾種。

所述特定基因甲基化特異性引物組包括上游甲基化特異性識(shí)別引物、上游通用擴(kuò)增引物和下游基因特異性引物。所述上游甲基化特異性識(shí)別引物的5’端連有接頭引物，3’端有修飾基團(tuán)。

所述上游甲基化特異性識(shí)別引物5’端接頭引物為“線性結(jié)構(gòu)”或“發(fā)卡結(jié)構(gòu)”接頭，所述3’端修飾為核酸類(lèi)似物或延伸阻斷修飾。

優(yōu)選地，所述核酸類(lèi)似物為L(zhǎng)NA、PNA中一種；所述延伸阻斷修飾為磷酸化修飾、ddC或C3 Spacer中的任意一種。