[發明專利]一種基于CRISPR/Cas9系統對新疆野蘋果基因多靶點定點突變的方法

在審

• 申請號: 201910729291.0
• 申請日: 2019-08-08
• 公開（公告）號: CN110408652A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 張道遠;張燕;周平;楊紅蘭;李小雙
• 申請（專利權）人: 中國科學院新疆生態與地理研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N9/22;A01H5/00;A01H6/74
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所(普通合伙) 65106
• 代理人: 張莉

1.一種基于CRISPR/Cas9系統對新疆野蘋果MsPDS基因多靶點定點突變的方法，其特征在于該方法是由克隆MsPDS基因，對MsPDS基因的5個不同的外顯子序列設計了sgRNA，并將含有編碼所述sgRNA序列的DNA片段連接到pYLCRISPR/Cas9載體中去，轉化新疆野蘋果葉片外植體，獲得定點編輯的愈傷組織及不定芽步驟完成，具體操作按下列步驟進行：

克隆MsPDS基因：

a、首先通過兩對引物Ms-PDS-F1，Ms-PDS-R1；Ms-PDS-F2，Ms-PDS-R2擴增得到了MsPDS基因的大部分全長，共5232bp，包含有9個外顯子；

對MsPDS基因的5個不同的外顯子序列設計sgRNA：

b、在MsPDS基因第3、4、5、6號外顯子的序列選擇了A、B、C、D、E 5個不同的靶位點，設計了5個不同的sgRNA，分別命名為sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，sgRNA4，sgRNA5；并針對不同的sgRNA序列設計了5對用于構建pYLCRISPR/Cas9載體的引物；

構建以雙靶點為例的多靶點pYLCRISPR/Cas9載體：

c、將5種sgRNA以sgRNA1 & sgRNA2， gRNA1 & sgRNA3，sgRNA3 & sgRNA4，sgRNA1 &sgRNA5，兩兩不同的組合方式，分別構建了4種雙靶點的pYLCRISPR/Cas9載體；

轉化根癌農桿菌EHA105：

d、將構建好的4種不同pYLCRISPR/Cas9載體，以液氮凍融法轉化根癌農桿菌EHA105；

轉化新疆野蘋果葉片外植體：

e、在步驟d得到的4種不同pYLCRISPR/Cas9的農桿菌分別浸染新疆野蘋果葉片外植體2d前，準備葉片外植體，首先將新疆野蘋果葉片去掉葉柄，用解剖刀垂直于中央葉脈橫切，將葉片等分為上下兩部分，以遠軸面接觸培養基的方式接種到誘導再生培養基，其中從葉片接種到誘導再生培養基開始，黑暗3周，其后以光照16h/d，光照強度2000Lx進行培養，培養溫度為24±1℃；

f、將帶有4種不同pYLCRISPR/Cas9載體的農桿菌菌株EHA105，在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的固體LB培養基上劃線，溫度28℃倒置培養36h；

g、在50ml的離心管里加入5ml LB培養基，同時加入50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，取平板上的單菌落，溫度28℃，180rpm培養24h；

h、將搖好的農桿菌菌液按照1:100的接菌量，接入到新的含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平液體的LB培養基中，擴大培養；5h后，檢測菌液濃度；當OD₆₀₀為0.6-0.8時， 3000g×10min，收集菌體，收集的菌體用農桿菌浸染液重懸至OD₆₀₀約0.6，然后溫度28℃活化1h，100rpm；

i、每25ml浸染液中放入步驟e中的已經培養2d的50片葉片外植體，室溫下以40rpm輕微震蕩培養20-25min，然后用無菌的濾紙吸干葉片外植體表面的菌液，將葉片外植體再次放入誘導再生培養基與農桿菌共培養2d；

j、共培養結束后，用無菌濾紙吸干葉片外植體上多余生長的農桿菌，葉片外植體轉移至延遲篩選培養基；

k、延遲篩選培養2d后，將葉片轉移至篩選抑菌培養基中培養，每30d更換一次培養基，直至愈傷組織和不定芽的再生。

2.根據權利要求1所述基于CRISPR/Cas9系統對新疆野蘋果MsPDS基因多靶點定點突變的方法，其特征在于所述植物培養基均為固體培養基，7g/L瓊脂。

3.根據權利要求1所述基于CRISPR/Cas9系統對新疆野蘋果MsPDS基因多靶點定點突變的方法，其特征在于步驟e和步驟i中誘導再生培養基為MS+4mg/L TDZ+1mg/L NAA。

4.根據權利要求1所述基于CRISPR/Cas9系統對新疆野蘋果MsPDS基因多靶點定點突變的方法，其特征在于步驟j中延遲篩選培養基為MS+4mg/L TDZ+1mg/L NAA+400mg/L 頭孢霉素。