[發明專利]Polβ過表達質粒、細胞模型及其在抗卵巢衰老藥物中的應用

有效

• 申請號: 201910728449.2
• 申請日: 2019-08-07
• 公開（公告）號: CN111118062B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 郭志剛;華科
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;A61K48/00;A61K38/45;A61K35/54;A61K35/545;A61P15/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 陳風平

本發明公開了Polβ過表達質粒、細胞模型及其在抗卵巢衰老藥物中的應用。Polβ過表達質粒導入細胞或者將Polβ基因導入卵細胞中，可顯著提高卵細胞抵御外界不良刺激，可以在制備抗卵巢衰老試劑或者藥物中應用。

技術領域

本發明涉及生物領域，具體涉及一種Polβ過表達質粒、細胞模型及在抗卵巢衰老藥物中的應用。

背景技術

研究表明，對于年齡介于30至35歲之間的女性，ART的懷孕率為50％。對于年齡在35到40歲之間的女性，懷孕率僅為30％。Belloc等人的一項研究。可以看出，ART目前并未完全代償由年齡相關的生殖能力下降引起的不育癥。

高齡導致的女性生殖能力下降以及胎兒染色體異常的增加是目前困擾女性生殖健康的最大挑戰。女性生育能力下降與卵細胞質量的下降以及卵巢中卵泡數量的下降密切相關。在女嬰剛出生時，其卵巢中卵細胞數量接近100萬枚左右，但是在女性一生中，僅僅只有約500枚卵細胞排出，這只占卵泡池0.1％，而剩下的約99.9％卵細胞是白白損耗掉，并且這種損耗的機制不明。卵泡池損耗從女嬰約1-3歲開始直到女性約51-52歲卵巢儲備耗竭為止，是一種非線性的加速過程。如果我們能找到在女性生殖后期卵泡池加速耗竭的原因，然后靶向治療，就能實現改善高齡女性生殖能力以及推遲更年期的目的。數字建模計算得出，如果能讓卵泡池耗竭減速，更年期能夠被推遲到約71歲。

在哺乳動物卵細胞中，同源重組修復在保護卵細胞的數量和質量方面起著重要作用。已有大量的研究表明，GV期卵細胞中DNA雙鏈斷裂修復缺陷是高齡導致卵巢儲備耗竭的原因。DNA雙鏈斷裂(DSBs)是最嚴重的并且破壞遺傳信息的完整性。由DNA損傷介導的毛細血管擴張性共濟失調(ATM)通過同源重組機制調節DSB修復。BRCA1和BRCA2是ATM DSBrepair家族基因中重要的成員。BRCA1蛋白與RAD51蛋白協同作用，并在同源重組修復中起關鍵作用。同時，它也是與CHK2協同調控有絲分裂進程的蛋白。刪除BRCA1將導致基因組不穩定，觸發P53介導的細胞周期檢查點。高齡中，參與DSB repair的BRCA1與ATM途徑中其他關鍵基因表達量較年輕少。如果DNA損傷不能被修復，細胞將會通過凋亡和衰老而被淘汰，退出細胞周期，從而避免非常嚴重的突變影響。

同源重組修復在保護卵巢內卵細胞的數量和質量上起著重要作用。已有大量的研究表明，GV(Germinal Vesicle)期卵細胞中DNA雙鏈斷裂修復(Double Strand BreaksRepair,DSBR)缺陷是高齡導致卵巢儲備耗竭的原因。同源重組發生在初級卵母細胞第一次減速分裂細線期，終止于雙線期。此后卵細胞在卵巢中停留數十年，直至接受激素刺激，獲得受精能力。在這漫長的數十年中，卵細胞要經歷來自體內和體外的不良環境刺激。修復DNA損傷的能力對于維持卵巢中卵細胞數量是至關重要的。因此，如果卵細胞不能應對DNA損傷，它將導致胚胎染色體異常并將缺陷遺傳給下一代。不同于先前大量研究聚焦在DNADSBR參與卵巢儲備維持上，休眠期的卵細胞已處于雙線期，此時已完成同源重組。此外，也有研究報道堿基切除修復(Base Excision Repair,BER)缺陷參與年齡相關的疾病發生。

人類首次從兔骨髓中純化獲得Polβ，其特征為小分子量DNA聚合酶，這為Polβ的系統研究拉開了帷幕。在哺乳動物中存在至少14種DNA聚合酶，根據它們的序列可變性將其分為A-，B-，RT-，X-和Y-五個家族。Polβ是在X家族中發現的第一種DNA聚合酶，該家族還包括Polλ、Polμ和末端轉移酶(TdT)。Polβ蛋白是一個大小為39KD由335個氨基酸組成的聚合酶，具有5’-dRP裂合酶和聚合酶兩個主要活力，它不具有核酸外切酶活性，并且在脊椎動物的整個生命過程中表達。Polβ具有小的分子量，被認為是細胞中最簡單的DNA聚合酶。此外，Polβ可通過大腸桿菌表達純化得到大量重組蛋白，這些特點使得它成為研究核苷酸轉移酶及裂合酶反應機制的理想模型。