[發明專利]一種納他霉素完全抗原的制備方法

有效

• 申請號: 201910715945.4
• 申請日: 2019-08-05
• 公開（公告）號: CN110437330B
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發明（設計）人: 鄭煒;趙雷;徐穎
• 申請（專利權）人: 寧波海關技術中心
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C12N15/81;C12N9/10
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

1.一種納他霉素半抗原的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）載體蛋白改性

將20mg的己二酸溶于5mL的pH值為6.5的MES溶液，然后依次加入50mg的碳二酰亞胺鹽酸鹽和50mg的N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫緩慢振蕩20分鐘后，加入5mL含20mg 中性粒細胞明膠轉移酶或牛血清白蛋白的MES溶液，室溫緩慢振蕩2小時；然后加入2mg的碘代乙酰胺，反應兩小時，在20mM MES溶液中過夜透析，透析兩次，即獲得改性后的載體蛋白；

（2）完全抗原合成

取10mg的改性載體蛋白牛血清白蛋白，加入0.04mg的碳二酰亞胺鹽酸鹽和0.05mg的N-羥基硫代琥珀酰亞胺；或者取10mg的改性載體蛋白中性粒細胞明膠轉移酶，加入0.08 mg的碳二酰亞胺鹽酸鹽和0.1mg的N-羥基硫代琥珀酰亞胺；輕輕振蕩20min后，置于冰上，加入含5mg的納他霉素的50wt% DMSO水溶液，室溫振蕩2小時，在20mM pH為7.4的PB溶液中過夜透析，即得納他霉素半抗原。

2.根據權利要求1所述的一種納他霉素半抗原的制備方法，其特征在于所述的中性粒細胞明膠轉移酶的制備方法如下：

（1）NGAL表達載體的構建

截取NGAL蛋白的片段：QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGCQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG，并在該序列N端加入6 X histag的序列CACCATCACCACCATCAC，然后通過EcoR I和BamH I位點，克隆到pHIL-S1載體上，再通過限制性內切酶Sal I線性化，電轉導入畢赤酵母GS115菌株中，鋪MD培養基平板；

（2）高表達克隆的篩選

從步驟（1）的平板中挑取20個克隆，分別加入到5mL的BMGY培養基中；24小時后，每24小時加入終濃度1wt%的甲醇；72小時后，取2mL菌液10000r/min離心1min，取上清用NGAL檢測試劑盒，挑取高表達的克隆，劃線并保菌；

（3）NGAL蛋白發酵與純化

從步驟（2）活化的平板上，挑取克隆，接種于5mL的含1vt%甘油的YNB培養基中，于28度培育24小時后，轉移至500mL的新鮮的含1vt%甘油的YNB培養基中，繼續培育24小時，轉入5L的含20mL的PTM1溶液及4vt%的甘油的BSM培養基，開始罐上發酵，用氨水調pH=5.0，待DO反彈上升時，再加100mL含1.2vt%PTM1溶液的50%甘油，溶氧下降；待DO反彈時，再加100mL含1.2vt%PTM1溶液的50%甘油，總共補加四次，最后一次補加后，調發酵液pH為6.0，待最后一次甘油消耗完，加入20mL甲醇，3小時后溶氧開始下降，以后每次DO反彈時，加入50mL含1.2vt%PTM1溶液的甲醇，直到發酵完成，甲醇誘導4小時后，每兩小時取樣檢測一次發酵濃度，發酵72小時后，NGAL的濃度不再上升，即可下罐；取發酵液10000rpm ，于4度離心20min，保留上清，加入終濃度10mM的咪唑，4度靜置過夜，用0.45um的膜過濾后，取濾過液用NTA鎳瓊脂糖柱進行純化，得到中性粒細胞明膠轉移酶蛋白。

3.根據權利要求2所述的一種納他霉素半抗原的制備方法，其特征在于：所述的NTA鎳瓊脂糖柱的平衡液為pH=6.0、含20mM咪唑的PBS溶液，洗脫液為pH=6.0含100mM咪唑的PBS溶液。