[發(fā)明專利]一種術(shù)中快速冰凍切片免疫組化染色方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910715250.6 | 申請日： | 2019-08-05 |
| 公開（公告）號： | CN110411808A | 公開（公告）日： | 2019-11-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李海南 | 申請（專利權(quán)）人： | 李海南 |
| 主分類號： | G01N1/30 | 分類號： | G01N1/30;G01N1/42 |
| 代理公司： | 廣州京諾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44407 | 代理人： | 麥超群 |
| 地址： | 510000 廣東*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 冰凍 滴加 孵育 免疫組化染色 冰凍切片 染色 切片 冷凍切片機 石蠟 病理診斷 免疫組化 染色過程 新鮮標(biāo)本 可比性 內(nèi)源性 蘇木素 載玻片 省略 準(zhǔn)確率 二抗 染液 顯色 一抗 粘貼 診斷 全程 | ||
一種術(shù)中快速冰凍切片免疫組化染色方法，包括以下步驟：將術(shù)中新鮮標(biāo)本放在冷凍切片機內(nèi)冰凍后切片，切片厚度為5μm，粘貼在載玻片上，空氣干燥25～35秒；滴加一抗在40℃下孵育4min；用PBS清洗三次，每次4～7s；滴加二抗在40℃下孵育4min；用PBS清洗三次，每次4～7s；滴加DAB試劑，顯色1～2mim；用蘇木素染液染色3～10s。染色過程免固定，免內(nèi)源性阻斷，提高孵育溫度，縮短反應(yīng)時間，免去可省略步驟縮短染色時間，大大縮短實驗總時間，全程時間約12分鐘，為實現(xiàn)協(xié)助快速冰凍病理診斷時間上提供可能性，提高冰凍診斷準(zhǔn)確率，與石蠟免疫組化結(jié)果有較好的重復(fù)性和可比性。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)病理檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種術(shù)中冰凍切片免疫組化染色方法。
背景技術(shù)
術(shù)中冰凍快速病理是在病人手術(shù)期間對其切除的小部分組織鏡下冰凍切片，快速給予初步病理診斷(<30min)，初步病理診斷將指導(dǎo)醫(yī)生下一步手術(shù)治療方案，具有重要的臨床價值。然而冰凍診斷具有一定局限性，不少腫瘤診斷僅依靠術(shù)中冰凍染色技術(shù)不能明確診斷，需要待術(shù)后石蠟標(biāo)本免疫組化檢查方可明確診斷，對這種情況，術(shù)中快速冰凍病理診斷就喪失了其指定手術(shù)治療方案的臨床價值。若能在快速冰凍病理診斷過程中快速獲得可靠的免疫組化染色結(jié)果將大大提高快速冰凍病理診斷的臨床價值。
隨著免疫組化技術(shù)的不斷改進(jìn)，免疫組化染色的質(zhì)量不斷提高，為手術(shù)中同時進(jìn)行冷凍切片快速免疫組化染色提供可能性，提供快速病理診斷增加手術(shù)操作性。如何能快速、便捷的在術(shù)中獲得可靠的實驗結(jié)果，是臨床應(yīng)用的關(guān)鍵點。在免疫組化染色過程中，一般需要將組織和細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整的保存下來地固定細(xì)胞，避免組織和細(xì)胞發(fā)生降解、自溶和變形等，使細(xì)胞和組織內(nèi)各種酶失去活性等；但是固定細(xì)胞在染色過程中占據(jù)一定時間且部分固定液會造成細(xì)胞收縮、對抗原損害、對蛋白質(zhì)有破壞等問題。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點，本發(fā)明的目的是提供一種術(shù)中快速冰凍切片免疫組化染色方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種術(shù)中快速冰凍切片免疫組化染色方法,包括以下步驟：
(1)將標(biāo)本放在冷凍切片機內(nèi)冰凍后切片，切片厚度為5μm，粘貼在載玻片1/3與2/3之間，空氣干燥25～35s；
(2)滴加一抗在40℃下孵育4min；
(3)用PBS清洗三次，每次4～7s；
(4)滴加二抗在40℃下孵育4min；
(5)用PBS清洗三次，每次4～7s；
(6)滴加DAB試劑，顯色1～2mim；
(7)用蘇木素染液染色3～10s。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟(1)中采用冰凍切片技術(shù)，避免石蠟切片存在的抗原修復(fù)問題，冷凍切片組織新鮮，沒有進(jìn)行化學(xué)處理，不存在抗原封閉途徑，因此也不需要做抗原修復(fù)。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟(1)中標(biāo)本取材不宜太大太厚，否則冰凍費時，太大難以切片，標(biāo)本長寬不超2.5cm為宜，高不超3mm。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟(1)中標(biāo)本不需要進(jìn)行固定，不需要鏡下內(nèi)源性阻斷，節(jié)約實驗時間同時保證結(jié)果更可靠及穩(wěn)定。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：還包括蘇木素染液染色后用流水沖洗反藍(lán),沖洗時間為10s，沖洗后用中性樹膠封片。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟(2)和步驟(4)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行孵育，恒溫箱恒定溫度為40℃。偏高的溫度加快了反應(yīng)時間，縮短實驗時間。
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