[發明專利]一種表達瑞替普酶rPA的細胞株及方法

有效

• 申請號: 201910711006.2
• 申請日: 2019-08-02
• 公開（公告）號: CN110819613B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 謝偉全
• 申請（專利權）人: 謝偉全
• 主分類號: C12N9/72
• 分類號: C12N9/72;C12N15/867;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 葛勝非

本發明屬于生物制藥領域，具體涉及一種人源細胞表達瑞替普酶的方法細胞株。該方法具體步驟為：基因合成含有分泌信號的編碼瑞替普酶的cDNA序列并插入慢病毒表達載體，構建可以分泌表達瑞替普酶的慢病毒載體，并包裝慢病毒顆粒，然后以此慢病毒顆粒感染人源細胞293F，以慢病毒載體內攜帶的嘌呤霉素抗性篩選高拷貝、穩定表達瑞替普酶的單克隆細胞株，測試瑞替普酶表達含量及酶活性，驗證建立的表達方法。本發明的優勢在于：本方法建立的瑞替普酶表達細胞株是人源293F細胞，不含有致熱源內毒素；并且表達細胞株是懸浮、穩定表達瑞替普酶，易于規?；糯螅瑫r是分泌表達瑞替普酶，雜質少，易于純化。

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，具體涉及一種以人源細胞分泌表達瑞替普酶rPA的新方法。

背景技術

當前，血栓栓塞是嚴重危害人類健康的常見心血管疾病，給病患個人、家庭及社會帶來沉重負擔。溶栓治療是目前治療血栓栓塞疾病的最有效手段。而瑞替普酶rPA是臨床應用較好的第三代溶栓藥物，rPA是人組織纖溶酶原激活劑tPA的缺失突變體，是一個單鏈非糖基化蛋白，分子量為39kDa，含9對二硫鍵。臨床上，rPA更容易作用于血栓內部，纖溶效果強、起效迅速。

鑒于栓塞病人的逐年增長，臨床上對瑞替普酶的需求量非常高。然而當前制備瑞替普酶的工藝主要是以大腸桿菌瞬時表達。該工藝生產的瑞替普酶多以包涵體形式存在，包涵體沒有生物學活性，必須經復性才有活性。然而包涵體復性損失量大，并且分子不均一。此外大腸桿菌表達產物?；煊袃榷舅氐戎聼嵩次镔|，臨床使用需要特定工序清除致熱源。另外有應用酵母、哺乳動物細胞生產瑞替普酶，成本高、周期長且得率較低。

本發明采用慢病毒載體將包含分泌信號的瑞替普酶編碼基因序列整合至人源細胞293F中，篩選可穩定分泌表達瑞替普酶的細胞株，由此得到的瑞替普酶可溶性表達、不含內毒素，且分泌表達簡化后續純化工藝，真正做到一步純化，活性鑒定也表明以此方法制備的瑞替普酶具有較好生物學活性。

發明內容

在一個方面，本發明提供了一種表達瑞替普酶rPA的方法，包括如下步驟：將包含編碼瑞替普酶基因的慢病毒顆粒感染宿主細胞；培養所述宿主細胞用于表達瑞替普酶；分離得到所述瑞替普酶。

在一個方面，所述宿主細胞為人源細胞。

在一個或多個實施方式中，所述人源細胞為293細胞，優選的，為293F細胞。

在一個實施方式中，所述慢病毒顆粒由plenti-rPA-puro質粒包裝得到。

在一個或多個實施方式中，所述質粒攜帶分泌信號及編碼瑞替普酶的cDNA序列。

在一個實施方式中，所述cDNA序列為：SEQ.ID No.2。

在一個實施方式中，其中，所述瑞替普酶的氨基酸序列為：SEQ.ID No.1。

在一個方面，本發明還提供了一種穩定高效表達瑞替普酶rPA的細胞株，由包含編碼瑞替普酶基因的慢病毒顆粒感染宿主細胞得到，所述宿主細胞為人源細胞，優選的為293細胞，更優選的，為293F細胞。

在一個實施方式中，所述瑞替普酶的氨基酸序列為：SEQ.ID No.1。

在一個實施方式中，所述慢病毒顆粒由plenti-rPA-puro質粒包裝得到。

在一個或多個實施方式中，所述質粒攜帶分泌信號及編碼瑞替普酶的cDNA序列。

在一個實施方式中，所述cDNA序列為：SEQ.ID No.2。

在另一個方面，本發明還提供了一種表達瑞替普酶rPA的方法，包括如下步驟：將慢病毒顆粒lenti-rPA-puro感染人源胚胎腎細胞293F，篩選得到高抗性的293F細胞株；篩選表達瑞替普酶的高抗性的單克隆細胞株293F-rPA；檢測瑞替普酶表達量；驗證表達高濃度且高活性rPA的單克隆細胞株。